Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.
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Articolo metodologico
Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un recente lavoro dimostra che il sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e tumorigenesi coinvolge popolazioni di cellule staminali (SCS) residenti all'interno del cervello adulto. Tuttavia, i meccanismi di queste cellule normalmente quiescenti impiegano per assicurare il corretto funzionamento delle reti neurali, così come il loro ruolo nel recupero da un infortunio e la mitigazione dei processi neurodegenerativi sono poco capito. Queste cellule risiedono nelle regioni denominate "nicchie" che forniscono un ambiente di sostegno che coinvolgono i segnali modulanti sia dal vascolare e immunitario. L'isolamento, la manutenzione e la differenziazione di CS del sistema nervoso centrale in condizioni di coltura definite che escludono fattori sconosciuti, li rende accessibili al trattamento con mezzi farmacologici o genetici, fornendo così spaccato il loro comportamento in vivo. Qui offriamo informazioni dettagliate sui metodi per la generazione di colture di SC SNC da regioni distinte del cervello adulto e approcci per valutare la loro dpotenziale ifferentiation in neuroni, astrociti, oligodendrociti e in vitro. Questa tecnica produce una popolazione omogenea di cellule come una coltura monostrato che può essere visualizzato per studiare individuale SC e la loro progenie. Inoltre, può essere applicato a diversi sistemi modello animale e campioni clinici, utilizzato in precedenza per prevedere le risposte di rigenerazione nel sistema nervoso adulto danneggiato.
Introduzione
Il dogma centrale della neurobiologia, stabilito dalle osservazioni fondamentali del citoarchitettura cervello fatto da Ramón Y. Cajal oltre un secolo fa, ha dichiarato che la neurogenesi è improbabile dopo l'adolescenza data la complessità delle reti neurali presenti nel sistema nervoso centrale 1. Nonostante il lavoro di Altman nel 1960, e successivamente Kaplan, dimostrando che 3 H-timidina è stato trovato in neuroni maturi che indicano che in realtà neuroni venivano generati in zone distinte del cervello adulto, il dogma continuato a tenere 2, 3. La prova ha continuato a montare con la ricerca di Nottebohm descrivere i cambiam....
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Protocollo
Il lavoro aderisce alla Dichiarazione di Helsinski e l'animale dichiarazione ARVO. Gli animali sono stati impiegati per la raccolta dei tessuti e tutti i metodi pertinenti sono state seguite secondo le istruzioni del stabulario dell'Università di Dresda. Gli animali sono stati maneggiati e custoditi secondo le linee guida federali tedesche per l'uso e la cura degli animali da laboratorio, e lo studio è stato approvato dal Landesdirektion Dresda. Si prega di consultare la politica veterinaria del proprio istituto (IACUC o l'altro bordo) per quanto riguarda una metodologia appropriata e l'eutanasia.
Azione specifica e le....
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Risultati
Identificare la regione di interesse che per raccogliere le cellule staminali neurali è il primo punto critico e definirà la quantità di tempo necessario per ottenere un piatto confluenti di cellule. Ad esempio, la SVZ è una zona neurogena classico e ha quindi una relativa proporzione elevata di cellule staminali neurali. Tuttavia, la tecnica qui presentata può essere utilizzato con altre regioni spesso non riconosciuti come aventi un potenziale neurogena robusto nell'età adulta. Ai fini del presente protocollo, abb.......
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Discussione
Molti dei passaggi critici all'isolamento successo, l'espansione e la differenziazione delle cellule staminali neurali dal cervello adulto sono condivise in comune con le tecniche di coltura di tessuti standard. L'obiettivo da tenere a mente è che le cellule staminali neurali isolate dal cervello adulto dovrebbe mantenere come molti dei loro caratteristiche in vivo come possibile (Figura 2J). Spesso un equilibrio tra la necessaria prudenza e velocità adeguata deve essere colpito. Ma.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato (in parte) dal Helmholtz Alliance ICEMED - Imaging e Malattie Metaboliche polimerizzazione ambientale, attraverso il Fondo Initiative e la rete dell'Associazione Helmholtz, una sovvenzione dalla Else Kroener-Fresenius Foundation, e un finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: cellule in tessuti).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti | BD Biosciences | 353934 | |
| Poli-L-ornitina | Sigma-Aldrich | P-3655 | 5 mg/ml soluzione madre preparata in acqua distillata doppia (stabile per diversi mesi a -20 ° C). Concentrazione di lavoro 0,5 mg/ml in acqua (stabile per 1 mese a 4 gradi; C). |
| Fibronectina | R& D Systems | 1030-Fn | Non agitare la soluzione madre |
| Apparecchio di filtrazione | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | Vedere la nota seguente per la preparazione completa del terreno N2 |
| Apo-transferrina | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M soluzione stock in ddH2O (stabile a 20 gradi; C per 6 mesi) |
| Selenito di sodio | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µ Soluzione madre M in ddH2O (stabile a -20 ° C per 6 mesi) |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µ Soluzione madre M in etanolo (stabile a -20° C per 6 mesi) |
| Penicillina/streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Mediatech | 21-040-CV | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) | R& D Systems | 233-FB | Concentrazione di lavoro 20 ng/ml |
| Delta4 (Dll4) | R& D Systems | 1389-D4 | Concentrazione di lavoro 500 ng/ml |
| Angiopoetina 2 (Ang2) | R& D Systems | 623-AN | Concentrazione di lavoro 500 ng/ml |
| Inibitore JAK | Calbiochem | 420099 | Concentrazione di lavoro 200 nM |
| Albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| Provette coniche da 15 e 50 ml | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| Altri articoli necessari includono: Strumenti di dissezione generale, tra cui lama di rasoio e pinze, Ratto adulto (3-6 mesi; Sprague-Dawley o Long Evans), camera di intossicazione CO2, Cappa a flusso laminare per colture cellulari e incubatore Incubatore (umidificato, 37 °C) C, 5% CO2, 5% O2). Nota: Per la preparazione completa dei terreni N2, a un flacone di DMEM/F-12 (500 ml) aggiungere 0,05 g di apotransferina, 0,0125 g di insulina (appena predisciolta in 1 ml di 10 mM di NaOH), 50 μ l di putrescina, 30 μ l di selenito di sodio, 100 μ l di scorte di progesterone e 5 ml di soluzione di penicillina/streptomicina. Regolare il pH a 7,2, se necessario. Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 gradi C per un massimo di 3 settimane e proteggere dalla luce. | |||
| Tabella dei reagenti per immunofluorescenza Microscopia | |||
| Paraformaldeide | Scienze | 15719 | |
| Siero d'asino normale (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock soluzione in metanolo |
| Tabella degli anticorpi primari | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | Fattore di diluizione: 1:400 Specie: Topo IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | Fattore di diluizione: 1:100 Specie: IgG di coniglio |
| Sox2 | R& Sistemi D | MAB2018 | Fattore di diluizione: 1:100 Specie: IgG2a di topo |
| CNPasi | Chemicon | MAB326 | Fattore di diluizione: 1:200 Specie: IgG1 di topo |
| β-tubulina III (TUJ1) | R& Sistemi D | MAB1195 | Fattore di diluizione: 1:500 Specie: IgG2a di topo |
| Proteina acida fibrillare gliale (GFAP) | Dako North America | Z0334 | Fattore di diluizione 1:500 Specie: Coniglio |
| Tabella degli anticorpi secondari | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | Fattore di diluizione: 1:200 Specie: Capra anti Topo IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | Fattore di diluizione: 1:200 Specie: Capra anti Topo IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | Fattore di diluizione: 1:200 Specie: Capra anti coniglio |
Riferimenti
- Cajal, R. Y. Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex. , Harvard University. (1899).
- Altman, J., Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).
- Kaplan, M. S.....
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Ristampe e permessi
