Neurala stamceller skördas från den vuxna hjärnan ökande utnyttjas i allt från grundläggande forskning av nervsystemets utveckling att utforska potentiella kliniska tillämpningar inom regenerativ medicin. Detta gör rigorös kontroll i isolerings-och odlingsförhållanden som används för att odla dessa celler kritiska att låta experimentella resultat.
Senaste arbete visar att det centrala nervsystemet (CNS) förnyelse och tumörbildning involverar populationer av stamceller (SCS) är bosatta i den vuxna hjärnan. Men mekanismerna dessa normalt vilande celler använder för att säkerställa väl fungerande neurala nätverk, samt deras roll i återhämtning från skada och begränsning av neurodegenerativa processer är lite förstås. Dessa celler är bosatta i områden som anges som "nischer" som ger en stödjande miljö med modulerande signaler från både kärl-och immunsystem. Isoleringen, underhåll och differentiering av CNS kaster under definierade odlingsbetingelser som utesluter okända faktorer, gör dem tillgängliga för behandling av farmakologiska eller genetiska metoder, vilket ger inblick i deras uppträdande in vivo. Här erbjuder vi detaljerad information om de metoder för att generera kulturer av CNS kaster från olika områden i den vuxna hjärnan och metoder för att bedöma deras differentiation potential till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter in vitro. Denna teknik ger en homogen cellpopulation som ett monolager kultur som kan visualiseras för att studera enskilda kaster och deras avkomma. Dessutom kan den tillämpas i olika djurmodellsystem och kliniska prover, som använts tidigare för att förutsäga regenerativa svar på den skadade vuxna nervsystemet.
Den centrala dogmen om neurobiologi, som föreskrivs i de grundläggande observationer av hjärnan cytoarchitecture gjorts av Ramón Y. Cajal över hundra år sedan, ansåg att neurogenes var osannolikt efter tonåren med tanke på komplexiteten i neurala nätverk som finns i CNS 1. Trots det arbete Altman på 1960-talet, och senare Kaplan, visar att 3 H-tymidin kunde hittas i mogna nervceller som indikerar att det faktiskt nervceller genereras i olika områden i den vuxna hjärnan, dogmen fortsatte att hålla 2, 3. Bevis fortsatt att öka med Nottebohm forskning som beskriver de säsongsmässiga förändringar i antalet nervceller som finns i songbird hjärnor 4. Det var inte förrän 1999, då Gould et al. Publicerade arbetet med generering av nervceller i hippocampus ökar med utförandet av associativa inlärningsuppgifter i råtta, samt observationer av Kornack och Rakic demonstrationsning fortsatt neurogenes i den vuxna makak att begreppet en mindre stel, mer plastisk hjärna, erkändes 5, 6.
Sökandet efter den cellulära källan för dessa de novo genererade nervceller leder till upptäckten av en diskret population av stamceller (SCS) som bor i områden av hjärnan kallas nischer 7. Den subventrikulära zonen och sub granulat zon av hippocampus anses vara de två huvudsakliga neurogena regioner 8,9. Celler som isolerats från dessa platser visar den klassiska kännetecken för embryon eller foster härledda kaster, självförnyelse och differentiering potential. I fallet med neurala stamceller (NSCs), de kan differentieras till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Dessutom är dessa SCS färgas positivt för fetala NSC markörer såsom det mellanliggande filamentproteinet nestin 10. Senare arbete belyser att kaster inte skulle begränsas till dessa two områden, och är i själva verket lokaliserade i hela hjärnan som en stor del vilande population av celler tätt förknippade med kärlsystemet 11.
Observationerna som kaster mobiliseras som svar på skada föreslår möjligheten att kunna använda dessa celler för regenerativ ändamål till stöd i återhämtningen från neurodegenerativ sjukdom och stroke 12, 13. Detta är inte helt olikt den roll som mesenkymala stamceller (MSC) spelar i läkning av bindväv, som finns som perivaskulära celler som har potential att bli osteoblaster, kondrocyter och fettceller 14. Däremot kan NSCs inte skördas på samma sätt som MSC från benmärg genom rutin aspiration och densitetsgradientcentrifugering tekniker och därefter utnyttjas i autologa cellbaserade terapier. Som en följd av andra källor av celler, såsom användningen av fetala NSCs eller neuronala prekursorer härledda från embryonic stamceller har stor omfattning undersökts i djursjukdomar och skademodeller med varierande framgång 15. Inducerade pluripotenta stamcellsteknik som utnyttjar somatisk cellkällor ger en annan potentiell väg för att producera terapeutiskt användbara cellbaserade terapier för ett brett spektrum av applikationer, övervinna den begränsade tillgången och etiska frågor när det gäller användning av embryonala celler och fostervävnader 16. Emellertid har kliniska översättningen av dessa rön visat sig vara en svår uppgift, vilket visas i den kamp för att behandla olika neurologiska tillstånd med SC-baserade behandlingsmetoder 17,18, samt en slingrande väg till reglerande godkännande. Som ett alternativt tillvägagångssätt, kan införandet av specifika farmakologiska behandlingar modulera NSC siffror och underlätta återhämtningen i modeller av Parkinsons sjukdom och stroke 19. Oavsett strategi kan vara, att förstå hur effektivt att manipulera dessa cellerkräver en tillgänglig in vitro-system.
Kulturer av NSCs kan utföras antingen som aggregerade kulturer, även känd som neurosfärer, eller som ett monolager 8,20. Båda teknikerna har använts i stor utsträckning, vilket möjliggör inrättandet av definierade odlingsbetingelser, det vill säga användning av epidermal tillväxtfaktor (EGF) eller basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) som en mitogen källa, som ger för utbyggnad av multi prekursorer. Medan neurosfärkulturer kan vara bättre lämpade för att studera klonal förökning förmåga av en isolerad celltypen, systemet har visat sig ge en blandad population av celler under expansion 21. Dessutom den slutna strukturen hos neurosfärer gör farmakologisk manipulation av cellerna opraktisk, och tolkningen av det inflytande dessa faktorer kan ha skulle kunna blandas ihop på grund av den mikromiljö som är etablerad inom neurosfären självt. Monoskiktkulturer, å andra sidan, kan varasysselsatta i hög genomströmning skärmar av små molekyler bibliotek, som ger ett kraftfullt verktyg för att utforska de signalöverföringsmekanismer som reglerar SC tillväxt och differentiering och öppnar möjligheten att upptäcka nya substanser som specifikt riktar denna cellpopulation.
Som en följd, kan förmågan att reproducerbart generera kulturer av vuxna NSCs från olika regioner av intresse i hjärnan användas i ett brett spektrum av forskningsansökningar, allt från utvecklingsstudier i det centrala nervsystemet (CNS) för att utforska nya regenerativ medicin metoder . Protokollet presenteras här visar hur man dissekera och utvärdera differentieringspotential CNS kaster isolerade från den vuxna gnagare hjärnan.
Många av de steg som är viktiga för framgångsrik isolering, expansion och differentiering av neurala stamceller från vuxen hjärna delas gemensamt med standardvävnadsodlingstekniker. Målet att komma ihåg är att NSCs isolerade från den vuxna hjärnan ska behålla så många av deras in vivo egenskaper som möjligt (Figur 2J). Ofta en balans mellan nödvändig försiktighet och lämplig hastighet måste träffas. Care med isolering av hjärnan från skallen kommer att göra en identifie…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats (delvis) av Helmholtz Alliance ICEMED – Imaging och Härdning Miljö metabola sjukdomar, genom initiativet och nätverksfond Helmholtz Association, ett bidrag från Else Kroener-Fresenius-stiftelsen, samt ett bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft ( SFB 655: Celler i vävnader).
6-well tissue culture dishes | BD Biosciences | 353934 | ||
Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P-3655 |
5 mg/ml stock solution prepared in double distilled water (Stable for several months at -20 °C). Working concentration 0.5 mg/ml in water (Stable for 1 month at 4 °C). |
|
Fibronectin | R&D Systems | 1030-Fn | Do not agitate stock solution | |
Filtration Apparatus | Corning Life Sciences | 430769 | ||
DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | See note below for complete N2 media preparation | |
Apo-transferrin | Sigma-Aldrich | T-2036 | ||
Insulin | Sigma-Aldrich | I-0516 | ||
Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | 1 M stock solution in ddH2O (Stable at 20 °C for 6 months) | |
Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S-5261 | 500 µM stock solution in ddH2O (Stable at -20 °C for 6 months) | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | 100 µM stock solution in ethanol (Stable at -20°C for 6 months) | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-040-CV | ||
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | R&D Systems | 233-FB | Working concentration 20 ng/ml | |
Delta4 (Dll4) | R&D Systems | 1389-D4 | Working concentration 500 ng/ml | |
Angiopoetin 2 (Ang2) | R&D Systems | 623-AN | Working concentration 500 ng/ml | |
JAK Inhibitor | Calbiochem | 420099 | Working concentration 200 nM | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-2058 | ||
15- and 50-ml Conical tubes | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | ||
Other necessary items include: General dissection instruments, including razor blade and forceps, Adult rat (3-6 months old; Sprague-Dawley or Long Evans), CO2 intoxication chamber, Laminar flow hood for cell culture and incubator Incubator (humidified, 37 °C, 5% CO2, 5% O2). Note: For complete N2 media preparation, to one bottle of DMEM/F-12 (500 ml) add 0.05 g of apotransferin, 0.0125 g of insulin (freshly predissolved in 1 ml of 10 mM NaOH), 50 μl of putrescine, 30 μl of sodium selenite, 100 μl of progesterone stocks, and 5 ml of penicillin/streptomycin solution. Adjust pH to 7.2, if needed. Filter-sterilize and store at 4 °C for up to 3 weeks and protect from light. | ||||
[header] | ||||
Immunofluorescence Reagents Table | ||||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15719 | ||
Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D-9663 | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | ||
4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D-8417 | 5 mg/ml stock solution in methanol | |
[header] | ||||
Primary Antibody Table | ||||
Nestin | Chemicon | MAB353 |
Dilution Factor: 1:400 Species: Mouse IgG1 |
|
Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Rabbit IgG |
|
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 |
Dilution Factor: 1:100 Species: Mouse IgG2a |
|
CNPase | Chemicon | MAB326 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Mouse IgG1 |
|
β-tubulin III (TUJ1) | R&D Systems | MAB1195 |
Dilution Factor: 1:500 Species: Mouse IgG2a |
|
Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) | Dako North America | Z0334 |
Dilution Factor 1:500 Species: Rabbit |
|
[header] | ||||
Secondary Antibody Table | ||||
Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG1 |
|
Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Mouse IgG2a |
|
Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 |
Dilution Factor: 1:200 Species: Goat anti Rabbit |