Добыча и Анализ кортизола от человека и обезьян волос
Summary
Кортизол (CORT) накапливается в растущей волоса человека и приматов. Мы описываем методы для извлечения и анализа волос Корт с высокой точностью и чувствительностью. Измерение волос CORT особенно хорошо подходит для оценки хронический стресс за периоды недель до месяцев.
Abstract
Гормон стресса кортизол (CORT) медленно включены в растущей волоса людей, приматов и других млекопитающих. Мы разработаны и утверждены способ добычи CORT и анализа от резус волос обезьяны и впоследствии адаптирована этот метод для использования с человеческий волос на голове. В отличие от Cort «точечных проб" из плазмы или слюны, волос CORT обеспечивает интегрированный меру гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система (HPA) деятельности, и, таким образом физиологический стресс, в период гормональной регистрации. Поскольку волосы головы человеческие растет со средней скоростью 1 см / месяц, уровни CORT, полученные из отрезков волос несколько см в длину может потенциально служить в качестве биомаркеров стресса испытали на протяжении ряда месяцев.
В нашем методе каждый образец волос сначала дважды промывают в изопропаноле, чтобы удалить любой Cort от наружной части волоса, которые были депонированы от пота или кожного сала. После сушкиОбразец измельчают в мелкий порошок, чтобы разбить белка матрицу волоса и увеличить площадь поверхности для добычи. CORT из внутренней части волоса экстрагируют метанолом, метанол выпаривают, и полученный экстракт восстанавливают в буфере для анализа. Извлеченные CORT, наряду с нормами и контроля качества, затем анализируют с помощью чувствительного и специфического коммерчески доступного иммуноферментного анализа (EIA) набора. Считывание из EIA преобразуется в пг CORT на мг порошкообразного массы волос. Этот метод был использован в нашей лаборатории для анализа волос Корт в людях, несколько видов макак, мартышек, собаки и белых медведей. Многие исследования как из нашей лаборатории и из других исследовательских групп продемонстрировали широкой применимости волос CORT для оценки хроническое воздействие стресса в естественных, так и лабораторные установки.
Introduction
Измерение CORT в крови, слюны или иногда в моче или кале был использован в качестве показателя физиологического стресса, так как открытие Селье роли оси НРА в стресса 1. Несмотря на многочисленные работы были опубликованы относящиеся HPA деятельность в остро стрессовые ситуации, поле было затруднено из-за отсутствия простого и надежного индекса хронического физиологического стресса. Эта проблема возникает потому, что плазма и слюны как выход «точечные» оценки HPA деятельности, которые подлежат циркадные изменения и может быть поражена нанесения ущерба окружающей среде. Мочи и кала образцы дают измерения CORT и / или метаболитов с мочой, которые охватывают ряд часов до целого дня в некоторых случаях. Коллекция из нескольких образцов с использованием любой из этих матриц может дать приблизительную сводный индекс уровнях Корт в течение долгого времени, однако, ни один из этих подходов не обеспечивает действительно долгосрочный индекс HPA деятельности и отзывчивость этого сишток в хронических стрессовых факторов.
Измерение Корт в волосах начался заполнить эту важную потребность в стресс литературы. Первоначальные исследования по нескольких лабораториях показали наличие CORT в человеческий волос, но не исследовали ли изменилось уровни волосы CORT в зависимости от стресса 2. Как наша лаборатория была заинтересована в течение многих лет в регуляции резус оси обезьяна HPA различными социальными и поведенческими факторами 3, мы приступаем к созданию и подтвердить методы извлечения и анализа резус волос обезьяны 4. Основываясь на том, что через кровь CORT медленно и непрерывно включены в растущих волос, цель этого нового метода в том, чтобы использовать уровни волос полученных CORT в качестве интегрированного индекса HPA деятельности за периоды недель до месяцев.
Несколько методологические проблемы встречались в разработке настоящий Протокол. Во-первых, предыдущие исследования показали, что небольшие количества Oе циркулирующих Корт из организма с потом и кожным салом и поэтому мог пальто с внешней поверхности волоса 2. В целях устранения этой потенциальной конфликтовать, мы разработали мягкий процедуру промывания, который появляется, чтобы удалить внешний Корт, имея минимальное влияние на CORT настоящий рамках растущего волоса. Таким образом, волосы обезьяна подвергнуты этой процедуре (т.е. две-три мин промывок изопропанола) потерял около 7-8% от общего содержания волосы CORT, а третий мыть удалены менее чем на 1% больше стероид от образца 4. Там, кажется, больше внешнего CORT в человеческий волос, так как та же самая процедура удаляется в среднем 27% общего содержания CORT из образцов (К. Розенберг и Дж. Мейера, не опубликовано). Как обезьяны волос, однако, дополнительный мытья содержится гораздо меньше Корт (около 7%), чем первых двух стирок. Таким образом, результаты как обезьяны и волос человека подтверждают утверждение, что большинство (если не все) внешний CORT может быть удалена при сохранении главную гидроразрывания CORT во внутренней матрице волос. Во-вторых, наши экспериментальные исследования также показали, что шлифовальные волосы перед экстракцией значительно увеличенный восстановление Корт от образца, предположительно разламывают сложный белковый матрицу волосяного стержня, а также увеличения площади поверхности, доступной для проникновения растворителя. Были разработаны два различных метода шлифовальные, каждый имеет свои преимущества и недостатки. Способ 1, который использует шаровую мельницу, имеет то преимущество, производя лучшие порошка. Тем не менее, шаровая мельница является относительно дорогой товар и оборудование, если они используются со стандартными размольных стаканов и шаров, он способен шлифования только два образца за один раз. Небольшие образцы также трудно обрабатывать с использованием шаровой мельницы со стандартными шлифовальных банки. Способ 2, которая использует beadbeater, является менее эффективным в своей шлифовальной способности. В результате, среднее восстановление CORT примерно на 10% ниже, с помощью этого метода по сравнению с шаровой мельнице (неопубликованные данные). С другой стороны, beadbeaterзначительно дешевле, чем шаровой мельнице, 16-24 Образцы могут быть отшлифованы сразу в зависимости от модели, и метод хорошо подходит для небольших образцов. Из-за упомянутой выше дифференциального восстановления, желательно использовать тот же метод измельчения для всех образцов в конкретном исследовании.
После того, как образцы волос были обработаны, они экстрагировали метанолом и CORT в экстрактах анализировали посредством чувствительного и специфического коммерческого набора EIA первоначально предназначенного для измерения слюнной Cort. Процедуры экстракции и аналитические были подтверждены в части, продемонстрировав, что серийные разведения экстрактов из образцов обезьяна волос дали показания ОВОС, что тесно параллельно показания, полученные из достоверных стандартов Корт. Затем мы показали, что волосы CORT (в дополнение к плазме и слюнной CORT) был чувствителен к крупной жизни стресс от административно мандатом переселения обезьян к новых жилых кварталов 4,5. Изложет документе приводится подробный отчет о методах, используемых обычно в нашей лаборатории для обработки образцов человека и обезьяны волос и извлекать и анализировать Корт из таких образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Процедура волосы CORT описано выше прост в исполнении, является относительно недорогим, делает использование легкодоступных химических веществ, реагентов и материалов, а также оборудование, которое требуется, за одним исключением, вероятно, будет присутствовать в типичной аналитическ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Kymberlee О'Брайен, Celia Мур, и Эдвард Tronick (факультет психологии, Университет Массачусетса, Бостон) за предоставление человека образцы волос, проанализированные в этом исследовании, и Стивен Суоми и Аманда Деттмер (Лаборатория сравнительной этологии, NICHD) для предоставление резус образцы обезьяна волос. Начальное развитие и дальнейшее использование этого метода была поддержана NIH RR11122 для MAN
Materials
| HPLC-grade isopropanol | Fisher | A451 | |
| HPLC-grade methanol | Fisher | A452 | |
| Salivary cortisol assay kits | Salimetrics | 1-3002 | See manufacturer's kit insert for information on assay sensitivity and specificity |
| 15-ml polypropylene screw-cap centrifuge tubes | Max Scientific | 10-9151 | |
| 1.5-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-25 | |
| 2.0-ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Fisher | 05-402-7 | |
| 2.0-ml XXTuff reinforced microvials | BioSpec | 330TX | Use with mini-beadbeater |
| 3.2-mm chrome-steel beads | BioSpec | 11079132c | Use with mini-beadbeater |
| 10-ml stainless steel grinding jars | Retsch | 02.462.0061 | Use with mixer mill |
| 12-mm stainless steel grinding balls | Retsch | 05.368.0037 | Use with mixer mill |
| Savant activated carbon cartridge | Fisher | DTK120R | Use with Savant chemical trap |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rotator for 15-ml centrifuge tubes | Fisher | S02135 | |
| Rotator for microcentrifuge tubes | Fisher | NC9854190 | |
| Benchtop centrifuge for microcentrifuge tubes | Fisher | 13-100-675 | |
| MM 200 mixer mill | Retsch | 20.746.0001 | |
| Mini-Beadbeater 16 | BioSpec | 607 | |
| Savant DNA Speedvac | Fisher | DNA120-115 | |
| Savant refrigerated vapor trap | Fisher | RVT400-115 | |
| Savant chemical trap | Fisher | SCT120 | Alternative to refrigerated vapor trap |
| Microplate reader | |||
| Microplate washer | |||
| Microplate mixer | |||
| Multichannel pipetter | |||
| Analytical balance |
Riferimenti
- Selye, H. Stress and the general adaptation syndrome. Br. Med. J. 1 (4667), 1383-1392 (1950).
- Meyer, J. S., Novak, M. A. Minireview: Hair cortisol: A novel biomarker of hypothalamic- pituitary-adrenocortical activity. Endocrinology. 153, 4120-4127 (2012).
- Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Lutz, C. K., Meyer, J. S. The physiology and neurochemistry of self-injurious behavior: A nonhuman primate model. Front. Biosci. 10, 1-11 (2005).
- Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques. Gen. Comp. Endocrinol. 147, 255-261 (2006).
- Davenport, M. D., Lutz, C. K., Tiefenbacher, S., Novak, M. A., Meyer, J. S. A rhesus monkey model of self injury: Effects of relocation stress on behavior and neuroendocrine function. Biol. Psychiatry. 63, 990-996 (2008).
- Kirschbaum, C., Tietze, A., Skoluda, N., Dettenborn, L. Hair as a retrospective calendar of cortisol production – Increased cortisol incorporation into hair in the third trimester of pregnancy. Psychoneuroendocrinology. 34, 32-37 (2009).
- Hamel, A. F., Meyer, J. S., Henchey, E., Dettmer, A. M., Suomi, S. J., Novak, M. A. Effects of shampoo and water washing on hair cortisol concentrations. Clin. Chim. Acta. 412, 382-385 (2011).
- Manenschijn, L., Koper, J. W., Lamberts, S. W., van Rossum, E. F. Evaluation of a method to measure long term cortisol levels. Steroids. 76, 1032-1036 (2011).
- Thomson, S., Koren, G., Fraser, L. A., Rieder, M., Friedman, T. C., Van Uum, S. H. Hair analysis provides a historical record of cortisol levels in Cushing’s syndrome. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 118, 133-138 (2010).
- LeBeau, M. A., Montgomery, M. A., Brewer, J. D. The role of variations in growth rate and sample collection on interpreting results of segmental analyses of hair. Forensic Sci. Int. 210, 110-116 (2011).
- Dolnick, E. H., Montagna, W., Dobson, R. L. Variability of hair growth in Macaca mulatta. Adv. Biol. Skin. IX, 121-128 (1969).
- Sauvé, B., Koren, G., Walsh, G., Uum Tokmakejian, S. V. a. n., H, S. Measurement of cortisol in human hair as a biomarker of systemic exposure. Clin. Invest. Med. 30, 183-191 (2007).
- Gow, R., Thomson, S., Rieder, M., Van Uum, S., Koren, G. An assessment of cortisol analysis in hair and its clinical applications. Forensic Sci. Int. 196, 32-37 (2010).
- Bechshøft, T. &. #. 2. 1. 6. ;., Sonne, C., Dietz, R., Born, E. W., Novak, M. A., Henchey, E., Meyer, J. S. Cortisol levels in hair of East Greenland polar bears. Sci. Total Environ. 409, 831-834 (2011).
- Cooper, G. A. A., Kronstrand, R., Kintz, P. Society of Hair Testing guidelines for drug testing in hair. Forensic Sci. Int. 218, 20-28 (2012).
- Ito, N., Ito, T., Kromminga, A., Bettermann, A., Takigawa, M., Kees, F., Straub, R. H., Paus, R. Human hair follicles display a functional equivalent of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and synthesize cortisol. FASEB J. 19, 1332-1334 (2005).
- Russell, E., Koren, G., Rieder, M., Van Uum, S. Hair cortisol as a biological marker of chronic stress: Current status, future directions and unanswered questions. Psychoneuroendocrinology. 37, 589-601 (2012).
- Stalder, T., Kirschbaum, C. Analysis of cortisol in hair – State of the art and future directions. Brain Behav. Immun. 26, 1019-1029 (2012).
- Staufenbiel, S. M., Penninx, B. W., Spijker, A. T., Elzinga, B. M., van Rossum, E. F. Hair cortisol, stress exposure, and mental health in humans: A systematic review. Psychoneuroendocrinology. 38, 1220-1235 (2013).
