Isolement de l'artère pulmonaire cellules musculaires lisses de souris néonatales

Summary

Nous avons développé une nouvelle technique et reproductible pour isoler les cultures primaires de cellules musculaires lisses de l'artère pulmonaire (PASMC) de souris dès l'âge de P7, ce qui permet une meilleure étude des voies de signalisation impliquées dans la contraction des cellules musculaires lisses néonatale et de détente.

Abstract

L'hypertension artérielle pulmonaire est une cause importante de morbidité et de mortalité chez les nourrissons. Historiquement, il ya eu une importante étude des voies de signalisation impliquées dans vasculaire contraction des muscles lisses dans PASMC de foetus de mouton. Alors que les moutons font un excellent modèle de l'hypertension pulmonaire terme, ils sont très chers et n'ont pas l'avantage de la manipulation génétique des souris. Inversement, l'incapacité à isoler PASMC de souris était une limitation importante de ce système. Ici, nous avons décrit l'isolement des cultures primaires de souris PASMC de P7, P14, P21 et souris en utilisant une variante de la technique décrite précédemment de Marshall et al. ²⁶ qui a déjà été utilisé pour isoler PASMC de rat. Ces PASMC murine représentent un nouvel outil pour l'étude des voies de signalisation dans la période néonatale. En bref, une suspension de 0,5% (p / v) d'agarose + particules de fer de 0,5% en M199 support est infusé dans le lit vasculaire pulmonaire par le ventricule droit (RV). Ledes particules de fer sont de 0,2 m de diamètre et ne peuvent pas passer à travers le lit capillaire pulmonaire. Ainsi, les pavillons de fer dans les petites artères pulmonaires (AP). Les poumons sont gonflés avec de l'agarose, enlevé et dissociées. Les récipients contenant du fer sont tirés vers le bas avec un aimant. Après la collagénase (80 U / ml) un traitement et autre dissociation, les vaisseaux sont placés dans une boîte de culture tissulaire dans M199 milieu contenant 20% de sérum de veau fœtal (FBS) et des antibiotiques (M199 milieu complet) pour permettre la migration des cellules sur la boîte de culture . Cette plaque initiale des cellules est un mélange 50-50 de fibroblastes et PASMC. Ainsi, l'attraction procédure baisse est répété plusieurs fois pour atteindre une population de PASMC plus pur et enlever le fer résiduel. Identité de la cellule musculaire lisse est confirmée par immunomarquage pour la myosine du muscle lisse et la desmine.

Introduction

L'hypertension artérielle pulmonaire est normale au cours de la vie intra-utérine depuis le placenta sert de l'organe majeur des échanges gazeux et seulement 10% du débit cardiaque est distribué à travers le lit vasculaire pulmonaire. In utero, les pressions pulmonaires sont semblables à des pressions systémiques en raison de la résistance vasculaire pulmonaire élevée . En gestation progresse, il ya une croissance rapide de la petite PA dans le poumon, la préparation du fœtus de l'augmentation spectaculaire du débit sanguin pulmonaire qui survient à la naissance ^1. Lorsque la transition périnatale normale échoue dans nourrissons nés à terme à court terme et complète, le résultat est l'hypertension pulmonaire persistante du nouveau-né (PPHN). PPHN est un syndrome clinique causé par de nombreuses pathologies sous-jacentes. Cependant, tous ces enfants ont des caractéristiques physiopathologiques communs tels que la résistance élevée pulmonaire vasculaire, l'hypoxémie, et shunt droite-gauche de la circulation sanguine à travers les connexions persistantes foetales telles que la persistance du canal artériel ou pourAmen ovale. PPHN affecte 2-6 pour 1000 naissances vivantes et transmet un risque de 8-10% de la mortalité ainsi que la morbidité significative à court terme et à long terme ^2. En outre, les poids de naissance prématurés très faibles peuvent développer une hypertension pulmonaire par suite de leur maladie pulmonaire sous-jacente. La maladie pulmonaire sous-jacente la plus fréquente des prématurés est une dysplasie broncho-pulmonaire (DBP). Bien que le risque global de BPD est corrélée avec l'âge gestationnel et le poids à la naissance, on ne sait pas pourquoi un sous-ensemble de ces nourrissons développe l'hypertension artérielle pulmonaire importante et la façon de traiter de manière appropriée ces nourrissons. Les mauvais résultats, y compris des hospitalisations prolongées et une mortalité accrue, sont communs ^3-6.

Historiquement, PASMC fœtus ovin ou porcin PASMC fœtus d'animaux sains ont été utilisées pour étudier les voies de signalisation impliquées dans la transition vasculaire pulmonaire normale après la naissance. Ceux-ci sont généralement isolés du cinquième PA de résistance de génération d'unn ovine ou porcine fœtus qui est livré et euthanasié avant toute respiration spontanée ^7-9. En outre, certains chercheurs ont isolé et utilisé PASMC d'un peu plus âgés et respirant spontanément agneaux et les porcelets à 3 jours, 2 semaines et 4 semaines ^10-12. Plus récemment, certains groupes ont réussi à isoler et utilisé PASMC isolé des agneaux avec PPHN d'examiner les dérangements dans les voies de signalisation de l'état de la maladie ^13-17. Ces cellules se sont révélés être un outil précieux pour étudier les voies de signalisation qui sont essentiels à la fois dans le système vasculaire pulmonaire normal et pathologique à court terme et long terme. Cependant, ils ne donnent pas un aperçu des voies de signalisation affectées chez les enfants prématurés atteints d'hypertension pulmonaire. Pas plus qu'ils ne permettent les possibilités de manipulations génétiques observés dans des modèles murins de la maladie.

des modèles de rats et de souris ont longtemps été utilisés pour modèle TPL et plus récemment sont utilisés pour modéliser hy pulmonairepertension résultant de BPD ^18-22. Rats nouveau-nés sont alléchantes pour travailler avec en raison de leur plus grande taille, mais ils souffrent aussi d'un manque de potentiel de la modification génétique. Les animaux génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour étudier les effets des gènes cibles spécifiques sur la physiologie de l'animal entier chez les souris néonatales, mais à ce jour personne n'a déjà réussi à isoler PASMC de ces petites souris. En isolant PASMC, plus d'informations peuvent être obtenues sur la façon dont les voies changent en réponse aux stimuli environnementaux et / ou modification génétique spécifiquement dans le muscle lisse de l'artère pulmonaire. En outre, en direct PASMC peut être visualisé en temps réel pour examiner les changements rapides de molécules de signalisation clés tels que le calcium et les espèces réactives de l'oxygène ^23-25. Nous avons récemment décrit l'isolement réussi de PASMC de souris adultes en utilisant une variante de la technique de Marshall et al. ²⁶ utilisé pour isoler rat PASMC ^23,25,26. Nous avons maintenant adapté unend étendu cette technique aux petites souris 7-21 jours d'âge (P7, P14, P21 et). La principale limitation de cette nouvelle technique d'isolation PASMC est qu'il nécessite plusieurs souris à produire suffisamment de cellules pour des expériences et que les cellules se développent très lentement, ce qui est caractéristique des cellules musculaires lisses primaires. Malgré ces limites, nous pensons que cette technique d'isoler PASMC néonatal de la souris permettra d'enquête améliorée de voies de signalisation clés impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle pulmonaire et représente une avancée significative dans ce domaine.

Protocol

La protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation de la Northwestern University ont approuvé ce protocole. 1. Isolement de l'artère pulmonaire de souris néonatales – Day One Préparer les médias complètes M199 – Mélanger 400 ml M199 avec 100 ml (concentration finale = 20%) chaleur FBS inactivé et 5 ml (concentration finale = 1%) pénicilline / streptomycine. Préparer le sérum gratuites M199 médias – M…

Representative Results

Pendant et après l'isolement, PASMC sont examinés à la fois par microscopie optique et par immunomarquage pour les marqueurs de cellules musculaires lisses. Par microscopie optique tôt dans le protocole, PASMC sont vus migration sur la boîte de culture de tissu du petit fer contenant navires (figure 1A). Après la mise en commun des plaques un à trois sur treize jours, puis les particules de fer ne sont plus considérés comme ceux-ci ont été retirées dans l'étape finale de mise en com…

Discussion

Dans ce manuscrit, nous décrivons pour la première fois l'isolement de PASMC de souris à P7, P14, P21 et. Pour ce faire, une suspension d'agarose et 0,2 particules de fer pm sont infusé à travers la RV dans le PA. En raison de la petite taille des particules de fer, ils ne peuvent pas passer à travers le lit capillaire pulmonaire et sont donc déposés dans la petite PA. Les poumons sont gonflés, enlevés et dissociés. Les récipients contenant du fer sont retirés de la solution à l'aide d'un a…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.