Isolering av lungearterien glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Summary

Vi har utviklet en ny og reproduserbar teknikk for å isolere primære kulturer av pulmonalarterien glatte muskelceller (PASMC) fra mus så unge som P7, og dermed gir bedre studie av signalveier involvert i neonatal glatt muskelcelle sammentrekning og avslapning.

Abstract

Pulmonal hypertensjon er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet hos spedbarn. Historisk har det vært en betydelig studie av signalveier involvert i vaskulær glatt muskulatur sammentrekning i PASMC fra fosterets sau. Mens sau foreta en utmerket modell av sikt pulmonal hypertensjon, er de veldig dyre og mangler den fordel av genetisk manipulering funnet hos mus. Omvendt, var den manglende evne til å isolere PASMC fra mus en betydelig begrensning for det systemet. Her har vi beskrevet isoleringen av primære kulturer av mus PASMC fra P7, P14, P21 og mus ved hjelp av en variant av den tidligere beskrevne teknikk for Marshall et al. ^26. som tidligere ble anvendt for isolering av rotte PASMC. Disse murine PASMC representerer en roman verktøy for studiet av signalveier i nyfødtperioden. Kort, en oppslemming av 0,5% (w / v) agarose + 0,5% jernpartikler i M199 medium blir tilført i pulmonalkar via den høyre ventrikkel (RV). Denjern-partikler er 0,2 mikrometer i diameter, og kan ikke passere gjennom lunge kapillære seng. Således er jern hytter i de små lungearterier (PA). Lungene er oppblåst med agarose, fjernet og distanserte. De jern-holdige fartøy er dratt ned med en magnet. Etter collagenase (80 U / ml) behandling og videre isolasjonen Fartøyene er satt inn i en vevskultur tallerken i M199 medium inneholdende 20% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika (M199 fullstendige media) for å tillate cellemigrering inn i kulturen rett . Denne første plate av celler er en 50-50 blanding av fibroblaster og PASMC. Således er det trekke ned prosedyre gjentas flere ganger for å oppnå et mer rent PASMC befolkning og fjerne alle rester av jern. Glattmuskelcellet identitet er bekreftet av farging for glatt muskulatur myosin og desmin.

Introduction

Pulmonal hypertensjon normale under intrauterin liv siden placenta tjener som hovedorgan for gassutveksling og bare 10% av minuttvolum som den sirkuleres mellom pulmonalkar. In utero, lunge presset er lik systemiske trykk på grunn av forhøyet pulmonar vaskulær motstand . Som svangerskapet utvikler seg, er det raske veksten av den lille PA i lungene, forbereder fosteret for den dramatiske økningen i pulmonal blodstrøm som oppstår ved fødselen ^en. Når den vanlige perinatal overgang mislykkes i nær sikt og full fullbårne barn, er resultatet vedvarende pulmonal hypertensjon hos nyfødte (PPHN). PPHN er et klinisk syndrom forårsaket av mange forskjellige underliggende patologi. Men alle disse barna har felles pathophysiologic funksjoner som forhøyet pulmonal vaskulær motstand, hypoksemi, og høyre-til-venstre shunt av blodet flyter over vedvarende fosterets tilkoblinger som ductus arteriosus eller foramen ovale. PPHN rammer 2-6 per 1000 levendefødte, og formidler en 8-10% risiko for dødelighet samt betydelige kortsiktige og langsiktige sykelighet ^to. I tillegg kan meget lav fødselsvekt premature barn utvikler pulmonal hypertensjon som et resultat av deres underliggende lungesykdom. Den vanligste underliggende lungesykdom av premature barn er bronkopulmonal dysplasi (BPD). Mens den generelle risikoen for BPD korrelerer med svangerskapsalder og fødselsvekt, er det fortsatt uklart hvorfor en undergruppe av disse barna utvikler betydelig pulmonal hypertensjon og hvordan du riktig behandle disse barna. Dårlige resultater, inkludert langvarige sykehusopphold og økt dødelighet, er vanlig ^3-6.

Historisk sett har sau fetal PASMC eller svin fosterets PASMC fra friske dyr blitt brukt til å studere signalveier involvert i normal pulmonal vaskulær overgang etter fødselen. Disse er vanligvis isolert fra femte generasjon motstand PA av enN sauer eller svin foster som er levert og avlives før enhver spontan respirasjon ^7-9. Dessuten har noen etterforskere isolert og utnyttet PASMC fra litt eldre og spontant puste lam og grisunger på tre dager, to uker og fire uker ^10-12. Flere nylig, har enkelte grupper lyktes i å isolere og utnyttet PASMC isolert fra lam med PPHN å undersøke derangements i signalveier i sykdomstilstanden ^13-17. Disse cellene har vist seg å være et verdifullt verktøy for å undersøke hvilke signalveier er avgjørende i både normal og sykelig kort sikt og sikt lunge blodkar. Men de gir ikke innsikt i signalveier påvirket hos premature barn med pulmonal hypertensjon. Heller ikke de lar mulighetene for genetisk manipulasjon sett i musemodeller av sykdom.

Rotte-og musemodeller har lenge blitt brukt til å modellere BPD og mer nylig blir brukt til å modellere pulmonar hypertension følge BPD ^18-22. Nyfødte rotter er fristende å jobbe med på grunn av deres større størrelse, men de også lider av mangel på potensial for genmodifisering. Genmodifiserte dyr har vært mye brukt for å undersøke effektene av spesifikke genet mål på hel dyrefysiologi i neonatal mus, men hittil ingen har tidligere lyktes i å isolere PASMC fra disse små mus. Ved å isolere PASMC, kan bedre informasjon fås om hvordan trasé endre seg i respons på miljømessige stimuli og / eller genetisk modifisering spesifikt i lungearterien glatt muskulatur. I tillegg kan leve PASMC avbildes i sanntid for å undersøke hurtige endringer i sentrale signalmolekyler som kalsium og reaktive oksygenforbindelser ^23-25. Vi har nylig beskrevet den vellykkede isolering av PASMC fra voksne mus ved hjelp av en variant av teknikken for Marshall et al. ^26. anvendt for isolering av rotte PASMC ^23,25,26. Vi har nå tilpasset ennd utvidet denne teknikken til små mus 7-21 dagers alder (P7, P14, og P21). Den primære begrensning til denne nye PASMC isolasjon teknikk er at den krever flere mus for å generere tilstrekkelig celler for forsøk og at cellene vokser meget langsomt, noe som er karakteristisk for primære glatte muskelceller. Til tross for disse begrensningene, tror vi denne teknikken til å isolere neonatal mus PASMC vil gi rom for den forbedrede etterforskningen av viktige signalveier er involvert i utviklingen av pulmonal hypertensjon og representerer et betydelig fremskritt på dette feltet.

Protocol

Institutional Animal Care og bruk Committee ved Northwestern University godkjent denne protokollen. En. Lungearterien Isolasjon fra Neonatal Mus – Day One Forbered Komplett M199 media – Mix 400 ml M199 med 100 ml (endelig konsentrasjon = 20%) varmeinaktivert FBS og 5 ml (endelig konsentrasjon = 1%) Penicillin / streptomycin. Forbered Serum Gratis M199 Media – Bland 500 ml M199 med 5 ml (endelig konsentrasjon = 1%) Penicillin / streptomyc…

Representative Results

Under og etter isolasjon, er PASMC undersøkt både ved lysmikroskopi og ved farging for glatt muskelcelle markører. Ved lysmikroskopi tidlig i protokollen, er PASMC sett migrerer på vev kultur tallerken fra den lille jern inneholder fartøy (figur 1A). Etter pooling plater en gjennom tre på dag tretten, da jern partikler er ikke lenger sett på som de som har blitt trukket ut i den endelige pooling trinn. I stedet blir en populasjon av PASMC sees på vevskultur konkavitet (figur 1B).</strong…

Discussion

I dette manuskriptet, beskriver vi for første gang isolering av PASMC fra mus ved P7, P14, og P21. For å oppnå dette, blir en oppslemning av agarose og 0,2 mikrometer jernpartikler sprøytet inn gjennom RV inn PA. På grunn av den lille størrelsen på de jern-partikler, kan de ikke passere gjennom lunge kapillære sengen og blir således avsatt i liten PA. Lungene er oppblåst, fjernet og distanserte. De jern-holdige fartøy er trukket ut av løsningen ved hjelp av en magnet. Til syvende og sist er skipene belagt i …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Bard Parker surgical blade handle	BD	371030
Stainless steel surgical blades #10 (sterile)	Miltex	4-310
Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)	BD	309657 and 306646
Needles (27 G, sterile)	BD	305109
Angiocatheter (24 G, sterile)	BD	381412
Monoject blunt cannula (15 G)	Kendall	SWD202314Z
Sutures	Fisher Scientific	NC9782896
Dynal magnet particle collector	Invitrogen	120-01D	This is a critical tool for the protocol.
Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)	BD	353001, 353004, and 353003	Any brand of tissue culture plates will be fine.
Iris Scissors (4 ½ inch stainless steel)	American Diagnostic Corporation	3424
Forceps (4 inch stainless steel)	Quick Medical	L5-5004
D-PBS	Mediatech	21-031-CV
M199 media	Mediatech	10-060-CV
Penicillin/streptomycin	VWR	TX16777-164NWU
Fetal bovine serum	Hyclone/Thermo Scientific	SH3091003	Heat inactivate at 55 °C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.
Iron particles (iron (II, III) oxide powder)	Aldrich Chemical Company	#31,006-9
Agarose	Sigma	A9539
Collagenase (made to 80 U/ml)	Sigma	C5138
Isoflurane	Butlet Schein	NDC 11695-6776-1
Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera	Nikon	TE2000-U	Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.
Anti-desmin antibody	Sigma	D-8281	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Anti-smooth muscle myosin	Biomedical Technologies	BT-562	Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.
Rhodamine-red anti-rabbit secondary	Molecular Probes/Invitrogen	R-6394	Use at 1:200 dilution for immunostaining.
Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera	Nikon	TE300	Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.
Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit	Enzo Life Sciences	BML-AK800-0001	This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.
Sildenafil	Sigma	PZ-0003	A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.