Kvantitativ bedömning av Human neutrofilmigrationen över en Odlade blåsans epitel
Summary
Vi utvecklade en in vitro-modell som efterliknar en viktig komponent i den akuta inflammatoriska svaret vid infektion i urinblåsan med uropatogena Escherichia coli. Den transuroepithelial neutrofil migration assay möjliggör kvantitativ bedömning av human neutrofil migration över blåsan epitel, odlades på permeabla bärare, som svar på bakterieinfektion eller kemo-attraherande ämnen.
Abstract
Den rekrytering av immunceller från periferin till inflammationsstället är ett viktigt steg i det medfödda immunsvar vid någon slemhinneyta. Vid infektion i urinblåsan, polymorfonukleära leukocyter (PMN, neutrofiler) migrera från blodet och passera epitelcellerna i urinblåsan. Underlåtenhet att lösa infektion i avsaknad av en neutrofil respons visar vikten av PMN i urinblåsan försvar. För att underlätta koloniseringen av epitelcellerna i urinblåsan, uropatogena Escherichia coli (UPEC), det orsakande medlet av majoriteten av urinvägsinfektioner (UVI), dämpa akuta inflammatoriska svaret med användning av en mängd olika partiellt definierade mekanismer. För att ytterligare undersöka samspelet mellan värd och bakteriell patogen, utvecklade vi en modell av denna aspekt av det medfödda immunsvaret mot UPEC in vitro. I transuroepithelial neutrofil migration assay, en variant av Boyden-kammare, odlad blåsan epithElial celler odlas till sammanflytning på undersidan av ett permeabelt stöd. PMN isolerades från humant venöst blod och matas till den basolaterala sidan av blåsan epiteliala cellskikten. PMN migration representerar fysiologiskt relevant basolaterala-till-apikal riktning som svar på bakteriell infektion eller chemoattractant molekyler är uppräknade med hjälp av en hemocytometer. Denna modell kan användas för att undersöka interaktioner mellan UPEC och eukaryota celler, samt att förhöra de molekylära kraven för korsande av blåsan epitel av PMN. Den transuroepithelial neutrofilmigration modellen kommer öka vår förståelse av den initiala inflammatoriska reaktion på UPEC i urinblåsan.
Introduction
Rörelsen av celler i hela kroppen, ofta över stora avstånd, som krävs för tillväxt och utveckling, sårläkning och immunsvar. Cell migration är komplex och kräver samordning av många olika processer, bland annat signalering kaskader och ombildning av cytoskelettala komponenter. Celler kan röra sig slumpmässigt (kemokines) samt mot definierade kemiska gradienter (kemotaxi). Många tekniker har utvecklats för att studera cellmigration in vitro. Den äldsta och vanligaste tekniken, den Boyden-kammaren består av en vertikal två-kammarsystem, där ett kemoattraherande Ämnet placeras i bottenkammaren och celler av intresse placeras i den övre kammaren 1. Rörelsen av celler över det permeabla filter med porer med definierad storlek, som skiljer de två kamrarna övervakas. Ytterligare tekniker har utvecklats för att undersöka cell migration, inklusive Zigmond kammare 2 och Dunn kammaren3. Har gett dessa gemensamma strategier betydande insikt i rörelse många olika celltyper.
Förutom att förhöra de grundläggande principerna för kemokines och kemotaxi, har två kammare analyser lättat utredningen av cellmigration genom extracellulära matrixkomponenter och både endotelceller och epitelceller cellager. En fördel med två kammarsystem framför andra tekniker är att det porösa membranet kan beläggas med proteiner såsom kollagen eller fibrinogen, och cellmigrering över en extracellulär matrisliknande barriär kan bedömas. Dessutom kan odlade cellinjer odlas och differentieras på de permeabla bärare. För att undersöka rörelsen av celler över en endotelial barriär, är odlade endotelceller sås och odlas i den övre behållaren av de permeabla bärare. Rörliga celler, såsom immunceller, sätts till den övre behållaren och migration in i den nedre behållaren över endothelial barriär i den fysiologiska apikal till basolateral riktning observeras. Denna modell har varit ovärderliga för att förstå extravasering av immuna celler ut ur blodströmmen. I motsats till transendotelial migrering sker rörelsen av celler över en epitelial barriär typiskt i den basolaterala-till-apikala riktningen. För att modellera dessa händelser in vitro, forskare frö och växa odlade epiteliala celler på undersidan av de permeabla bärare. Rörliga celler sättes till den övre behållaren och migration över den epiteliala barriären, vilket motsvarar den basolaterala-till-apikala riktning, övervakas. Sådana modeller av transepitelial migration har väsentligt bidragit till vår förståelse av inflammatoriska reaktioner på slemhinnor, särskilt de av lungan och gut 4,5.
Däremot har immunceller människohandel genom epitelet i urinvägarna fått mycket mindre uppmärksamhet. Att främja vårt understanding av medfödda immunsvar i urinvägarna under infektion med uropatogena Escherichia coli (UPEC), utvecklade vi en in vitro-analys, den transuroepithelial neutrofilmigrationen analys, som möjliggör undersökning av polymorfonukleär leukocyt (PMN, neutrofiler) rörelse över en blåsa epitelial barriär 6 -8. Som med andra två-kammar modeller av transepitelial migration, är odlade humana blåsan epitelceller odlades på undersidan av ett permeabelt stöd och bilda konfluenta epiteliala skikt. Humana neutrofiler, som isoleras från venöst blod, skall tillämpas på den basolaterala sidan av epiteliala skikt, och migration över epitelet i fysiologiskt relevant basolaterala-till-apikala riktningen kvantifieras som svar på infektion med olika stammar av E. coli eller förekomsten av chemoattractant molekyler. Mycket forskning har fokuserat på neutrofil rörelse, både kemokines och kemotaxi, i avsaknad av ytterligare celltyper. Den transuroepithelial neutrofilmigration analysen är fördelaktigt eftersom det tar hänsyn till komplexa interaktioner mellan urinblåsan epitelceller och immunceller under infektion. Detta lätthanterlig in vitro-modell har potential att möjliggöra detaljerad undersökning av immunsvar vid uroepithelial ytor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med hjälp av en odlad blåsa epitelcellinje och nyligen isolerade humana PMN, etablerade vi en modell av transuroepithelial neutrofilmigrationen in vitro. Denna modell har varit avgörande börjar dissekera komplexiteten i det medfödda immunsvaret vid urinvägsinfektion (UVI), en mycket vanlig bakteriell infektion orsakas vanligtvis av UPEC 9. Under infektion av urinblåsan, eller cystit, är nödvändig för bakteriell clearance 10 rekrytering av PMN till blåsan lumen. Att etablera ett…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) beviljar R01-DK080752 och P50-DK064540. Vi tackar J. Loughman för hennes insatser i upprättandet av denna analys.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Transwell Inserts (i.e. permeable supports) | Corning | 3472 | 6.5 mm, 3 μm pore, polyester membrane insert |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes | Becton, Dickinson and Company (BD) | 366480 | 16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin |
| BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set | Becton, Dickinson and Company (BD) | 367281 | 21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing |
| BD Vacutainer one-use, nonstackable holder | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364815 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | D4876 | From Leuconostoc mesenteroides |
| Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Ultra-Low Attachment Plates | Corning | 3473 | 24-well, clear flat bottom |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) | Sigma-Aldrich | F3506 | Reconstituted in DMSO to 10 mM |
| Recombinant Human CXCL8/IL-8 | R&D Systems | 208-IL | Reconstituted in PBS to 100 μg/ml |
Riferimenti
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Orientation chamber in chemotaxis. Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria. Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).
- Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration. Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).
- Loughman, J. A., Hunstad, D. A. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection. J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).
- Haraoka, M., et al. Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection. J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).
- Billips, B. K., et al. Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).
- Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Säve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration. Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
