In vitro Traumatisk hjerneskade modeller blir utviklet for å reprodusere in vivo hjernen deformasjon. Stretch-indusert skade har vært ansatt i astrocytes, nevroner, gliaceller, aorta og hjerne endotelceller. Imidlertid anvender systemet en blod-hjerne barrieren (BBB) modell som besitter egenskaper som utgjør en legitim modell av BBB for å etablere en in vitro modell TBI.
På grunn av den høye dødelighet hendelsen forårsaket av traumatisk hjerneskade (TBI), fremgangsmåter som vil muliggjøre en bedre å forstå de underliggende mekanismer som er involvert i den er nyttig for behandling. Det finnes både in vivo og in vitro metoder tilgjengelig for dette formål. In vivo-modeller kan etterligne faktiske hodeskade så det oppstår under TBI. Imidlertid kan in vivo-teknikker ikke utnyttes for studier på cellefysiologi nivå. Derfor har in vitro-metoder er mer fordelaktig for dette formål siden de gir lettere adgang til cellene og det ekstracellulære miljø for manipulasjon.
Vår protokoll presenterer en in vitro modell av tbi ved hjelp strekk skade i hjernen mikrovaskulære endotelceller. Det utnytter trykket til celler dyrket i fleksibel-bunn brønner. Det trykk som påføres kan lett kontrolleres og kan produsere skade som varierer fra lav til alvorlige. Den murinehjerne mikrovaskulære endotelceller (cend) genereres i vårt laboratorium er en godt egnet modell for blod-hjerne barrieren (BBB) og dermed gi en fordel til andre systemer som bruker en lignende teknikk. I tillegg, på grunn av enkelheten av metoden, blir eksperimentelle oppsett kan lett dupliseres. Således kan denne modellen benyttes i å studere de cellulære og molekylære mekanismene som er involvert i tbi ved BBB.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en av de ledende dødsårsakene i verden. Om lag 10 millioner mennesker er berørt årlig av TBI som gjør det en stor helse og medisinsk problem en. På grunn av dette, har forskjellige in vivo-og in vitro-modeller av TBI er etablert og utviklet for å studere dens mekanismer 2,3,4. En bedre forståelse av TBI kan bidra til å forbedre pasientens behandling og reduksjon av den tilknyttede dødelighet, sykelighet og kostnad.
Mange modeller for hjerneskade som utnytter både in vivo og in vitro-metoder finnes. In vivo modeller kunne etterligne det faktiske tilfelle hodeskade. Imidlertid, på grunn av kompleksiteten av in vivo situasjonen, tilgjengelighet til vevet av interesse blir begrenset 2.. I å forstå de fysiologiske responsen av individuelle celler som et resultat av skaden påført, er det viktig at cellene er isolert fra de systemiske effekter somkan hemme eller endre deres individuelle respons fem. Av denne grunn, cellulære modeller av traumer gir verdifulle fordeler fremfor dyremodeller siden den mekaniske miljø av cellene kan kontrolleres nøyaktig 6..
In vitro-systemer som benytter bruken av mekanisk belastning til celler eller vev for å bestemme endringer indusert ved en slik metode for skade er blitt utviklet. For eksempel, har en fremgangsmåte for å studere effekten av mekanisk skade på celler blitt etablert for astrocytter, nerveceller, glialceller og aorta endotelceller 7,8,9. In vitro traumer modell etablert for studier av gnagere og menneskelig astrocyte reaktivitet 10 ansatt en trykkreguleringsanordning identisk med hva vi bruker for vår modell. Den samme metoden ble brukt for å indusere skade gjennom strekningen i mus hjernen microvessel endotelceller (bEnd3) 11 og kortikale nevroner 12,13 samt, cerebral endothelial celler fra nyfødte grisunger 14. Anordningen deformerer bunnen av kulturen godt for derved å produsere mekanisk strekning skade 10 år. Det påfører skade på dyrkede celler ved anvendelse av lufttrykket over cellene. Dette trykket kan bøye membranen hvorpå cellene vokser, og derved strekke cellene. Forskjellige grader av strekk (dvs. "lav," moderat ", eller" alvorlig ") kan oppnås ved å innstille lufttrykket puls varighet og intensitet tilsvarende. Denne metoden for strekk-indusert skade er blitt korrelert med traumatisk skade in vivo 7.. Videre , denne metoden for skade tillater nøyaktig kontroll av det ekstracellulære miljø og lett kan reproduseres.
Selv om en lignende tilnærming har vært brukt i mange andre hjernen celletyper, inkludert bEnd3, er vår modell av en fordel ved at det gjør bruk av murine hjerne mikrovaskulære endotelceller (cend) genererti vårt laboratorium. Denne cellelinjen er et godt egnet modell for blod-hjerne barrieren (BBB). In vitro-cellekulturer som brukes som BBB modeller bør besitte egenskaper som ville gjøre dem i stand til å tjene som permeabilitet skjerm. Et viktig kriterium for en in vitro celle-modellen å være en prediktor for BBB permeabilitet er at den bør ha fysiologisk realistisk celle arkitektur 15.. Selv om bEnd3 celler viser karakteristiske spindel-lignende skvamøst morfologi i kultur 16, viser de uregelmessig morfogenetiske atferd in vitro der de danner cyste-lignende hulrom i stedet for de vanlige rørformede strukturer i fibrin gels 17. Dessuten, når cellene ble injisert i embryonale og nyfødte mus, induserte de hurtig voksende svulster dødelig for embryonale mus, men ikke i nyfødte og unge mus. Det er derfor foreslått at en eller flere prosesser som styrer normal endotelial vekst, migrasjon og differensiering har blitt endret eller elimineresed i denne cellelinje 18. På den annen side, morfologiske, immuncytokjemisk evaluering av endotel-og BBB markør uttrykk, bioelektriske, og paracellular fluks målinger viser at vår modell BBB cend er faktisk en egnet modell av BBB 19..
Brain endotel in vivo er preget av et svært stramt permeabilitet med trans-endotelial elektrisk motstand (Teer) som strekker seg fra 2,000-5,000 2 Ωcm. For studier av hjernen microvasculature barriere egenskaper til legemidler, bør paracellular restrictiveness og tetthet av cellene bli vurdert. I de fleste hjernen kapillære endotelceller (BCEC), dette er ikke bevart som cellene utstillingen Teer spenner 50-100 Ωcm 2 20. Den udødeliggjort hjerne endotelceller linjen bEnd3 genererer Teer verdier av ikke større enn 60 Ωcm 2 15. I motsetning differensiering av cend celler med medium som inneholder redusert serum skjermTeer verdier som spenner 300-500 Ωcm 2 19,21.
Til dags dato, in vitro modeller av strekningen skade i dyrkede hjerne endotelceller er knappe. Derfor kan en in vitro-modell for traumer gjennom strekningen skade anvendelse av dyrkede hjerne endotel celler som fungerer som modell av BBB vise seg å være nyttig. I denne protokollen, vil vi presentere en in vitro modell som kunne etterligne den faktiske virkningen at hjerneceller, spesielt hjernen mikrovaskulære endotelceller i BBB, mottar under TBI. Den største fordelen med denne modellen er at mengden av skader påført cellene samt ekstracellulære miljøet lett kan kontrolleres på en presis måte muliggjør enkel reproduserbarhet av eksperimentelle oppsett.
Effektene av mekanisk skade in vitro har vært studert og metoder har blitt etablert for astrocytter, nerveceller, glialceller og aorta endotelceller 8, 9, 22. Det er imidlertid hittil fremdeles ingen kjente in vitro modell av strekk skade i hjernen dyrkede endotelceller. Cellular modeller av traumer gir verdifulle fordeler fremfor dyremodeller siden den mekaniske miljø av cellene kan kontrolleres nøyaktig 6.. Derfor er en in vitro modell for traumer gjennom strekningen skade anvendelse av dyrkede endoteliale hjerneceller som fungerer som modell for blod-hjerne barrieren (BBB), slik som hva protokoll presenterer kan vise seg å være nyttig.
Denne protokollen gjør bruk av cend celler, en etablert BBB modell i vårt laboratorium. Siden BBB sammenbrudd er ofte dokumentert i TBI pasienter og TBI er ofte knyttet til avbrudd av BBB som kan føre til ødem dannelse 23, 24, pres metodenented her kan spesielt bli brukt i å gjennomføre BBB studier i forhold til hodeskader.
I denne modellen, er det viktig å ta vare på hvor stor grad av strekk skade påføres på cellene. I så mye som cellene er skadet i alle fall, og med hva mengden av trykket er brukt, graden av skade som kan påvirke endotelceller avviker mye sterkt fra andre celler typer. Aorta endotelceller er mer motstandsdyktig mot strekke skade enn astrocytes eller blandet gliaceller ni. I tillegg reparere de mer hurtig etter skade i forhold til andre celletyper. Derfor er for hjerne endotel celler, spesielt celler, cend større mengde av strekk skade nødvendig for å produsere en høy grad av skade. Man kunne oppnå den ønskede grad av skade ved å anvende det tilsvarende trykk angitt i Tabell 1. For cend celler, er imidlertid alvorlig skade foretrukket på grunn av deres motstand mot påkjenninger. De LDH analyser utført visteat etter hvert som graden av strekningen øker, er mer LDH skilles ut i supernatanten. I kontrast, produserte cellene som ble gitt en lav mengde strekk skade LDH i en mengde som ligner på kontrollcellene. Som nevnt i protokollen, må man passe på at den passende mengde av mediet brukes ettersom en økning eller reduksjon av mengden av mediet kan føre til forskjeller i topptrykket anvendt til brønnene. For eksempel registrerer en brønn inneholdt 5 ml av væsken en topptrykk i gjennomsnitt på 4,0 psi mens en tom også registrerer et gjennomsnitt på 3,8 kPa ved 45 psi trykk utøves. Derfor er det best å presse utløser flere ganger over en kontroll samt å sikre at topptrykket som vil bli generert svarer til den ønskede mengde.
I våre forsøk har vi brukt et levedyktighet beis for å bestemme effekten av strekningen til permeabiliteten til cellemembranen. Optikk av fleksible-bunn kultur plater vi brukte gjør oss i stand til VIew de fargede cellene direkte under mikroskopet. Men når man ønsker å gjennomføre immunolabelling studier direkte etter strekk-skade, kan problemer oppstå. Først, kan størrelsen og tykkelsen av platen utgjøre et problem med noen mikroskop visning plattformer. Sekund, kan optikken av fleksibel membran av godt være en hindring for å fjerne visning.
Til tross for de nevnte begrensninger, kan imidlertid den beskrevne fremgangsmåte kan brukes som en modell for in vitro mekanisk skade av BBB. Traumatisk hjerneskade (TBI) omfatter to komponenter, nemlig, iskemi og traume. Ischemi kan forekomme som en sekundær skade etter TBI i tilfeller når det er alvorlig blodtap resulterer i lavt blodtrykk eller som et resultat av hjerneødem begrense oksygentilførselen til hjernen. Det er regnet som en forsinket, ikke-mekanisk skade som representerer påfølgende patologiske prosessene igangsatt i øyeblikket for skade 25. Forekomsten av en hypoksifter alvorlig traumatisk hjerneskade er vanlig 26. Oksygen glukose deprivasjon (OGD) er den metoden som brukes nå til modell iskemi in vitro. Således kan utsette cellene for å OGD som en sekundær hån mot cellene etter strekning etterligne forekomsten av TBI etterfulgt av iskemi. Derfor, for å forbedre vår nåværende in vitro modell av TBI og mønster det så nært som mulig til en faktisk TBI som det skjer in vivo, i fremtiden vil vi også ansette OGD i kombinasjon med stretch skade.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation) i henhold til prosjekt nummer FO 315/4- og EU Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) i henhold Grant avtale No HELSE-F2-2009-241778 til CF.
Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |