In vitro traumatisk hjerneskade modeller er under udvikling til at gengive in vivo hjerne deformation. Stretch-induceret skade har været ansat i astrocytter, neuroner, gliaceller, aorta og hjerne endotelceller. Men vores system anvender en blod-hjerne barrieren (BBB) model, der besidder egenskaber, der udgør en legitim model af BBB til at etablere en in vitro TBI model.
Grund af den høje dødelighed hændelse som følge af traumatisk hjerneskade (TBI), metoder, der vil gøre det muligt at bedre at forstå de underliggende mekanismer involveret i det er nyttige til behandling. Der er både in vivo og in vitro metoder til rådighed til dette formål. In vivo modeller kan efterligne selve hovedet skade, da det sker under TBI. Dog kan in vivo teknikker ikke udnyttes for studier på cellens fysiologi-niveau. Derfor, in vitro-metoder er mere fordelagtige til dette formål, da de giver lettere adgang til cellerne og det ekstracellulære miljø for manipulation.
Vores protokol viser en in vitro model af TBI hjælp stræk skade i hjernen mikrovaskulære endotelceller. Det udnytter tryk påføres celler dyrket i fleksible-bund. Trykket påføres let kan styres og kan producere skade, der spænder fra lav til svær. Det murinehjerne mikrovaskulære endotelceller (cEND) genereret i vores laboratorium er en velegnet model for blod-hjerne barrieren (BBB), hvilket giver en fordel til andre systemer, der anvender en lignende teknik. Desuden, på grund af enkelheden af fremgangsmåden er eksperimentelle opsætninger let duplikeres. Således kan denne model anvendes til at studere cellulære og molekylære mekanismer involveret i TBI på BBB.
Traumatisk hjerneskade (TBI) er en af de førende dødsårsager på verdensplan. Omkring 10 millioner mennesker er ramt årligt af TBI gør det til en stor sundheds-og medicinsk problem 1.. På grund af dette, har forskellige in vivo og in vitro modeller af TBI blevet etableret og udviklet til at studere dens mekanismer 2,3,4. En bedre forståelse af TBI kan hjælpe med at forbedre patientbehandlingen og mindske den dermed forbundne dødelighed, sygelighed og omkostninger.
Mange modeller for hjerneskade som udnytter både in vivo og in vitro metoder eksisterer. In vivo modeller kunne efterligne den faktiske tilfælde af hovedlæsion. Men på grund af kompleksiteten af in vivo-situationen, adgang til vævet af interesse bliver begrænset 2. For at forstå den fysiologiske reaktion af individuelle celler som følge af den påførte skade, er det vigtigt, at cellerne er isoleret fra de systemiske virkninger, somkan hæmme eller ændre deres individuelle respons 5.. Af denne grund giver cellulære modeller af traumer værdifulde fordele i forhold dyremodeller siden mekaniske miljø af cellerne kan styres præcist 6.
In vitro-systemer, som anvender brugen af mekanisk belastning til celler eller væv for at bestemme ændringer induceret ved en sådan fremgangsmåde skade er blevet udviklet. For eksempel har en metode til at studere virkningen af mekanisk skade på celler blevet etableret for astrocytter, neuroner, gliaceller og aorta endotelceller 7,8,9. In vitro traume model etableret for studiet af gnaver og menneskelige astrocyt reaktivitet 10 ansat en trykreguleringsanordning identisk med, hvad vi bruger til vores model. Samme metode blev anvendt til at fremkalde skade gennem stræk i mus hjerne mikrokar endothelceller (bEnd3) 11 og kortikale neuroner 12,13 samt, cerebral endothelial celler fra nyfødte grise 14.. Enheden deformerer bunden af kulturen godt derved frembringer mekanisk stretch skade 10.. Det påfører skade ved dyrkede celler ved anvendelse af lufttryk over cellerne. Dette pres kan afbøje membranen, hvorpå cellerne vokser og derved strække cellerne. Forskellige grader af stretch (dvs. "lav," moderat "eller" alvorlig ") kan opnås ved at indstille lufttrykket puls varighed og intensitet i overensstemmelse hermed. Denne metode til stretch-induceret skade er blevet korreleret med traumatisk skade in vivo 7.. Desuden denne form for skade giver mulighed for præcis styring af den ekstracellulære miljø og kan let reproduceres.
Selv om en lignende fremgangsmåde er blevet anvendt til mange andre hjerne celletyper, herunder bEnd3, vores model er en fordel i, at det gør brug af de murine hjerne mikrovaskulære endotelceller (cEND) generereti vores laboratorium. Denne cellelinie er en velegnet model af blod-hjerne barrieren (BBB). In vitro cellekulturer anvendes som BBB-modeller bør besidde egenskaber, der gør dem i stand til at tjene som permeabilitet skærm. Et vigtigt kriterium for en in vitro-celle model kan være en indikator for BBB permeabilitet er at det skal besidde fysiologisk realistisk celle arkitektur 15.. Selvom bEnd3 celler vise karakteristiske spindel-lignende skvamøs morfologi i kultur 16 udviser de uregelmæssige morfogenetiske adfærd in vitro, hvorved de danner cyste-lignende hulrum snarere end de regelmæssige rørformede strukturer i fibrin geler 17.. Desuden, når cellerne blev injiceret i embryoner og nyfødte mus, de inducerede hurtigt voksende tumorer dødelige til embryonale mus, men ikke hos nyfødte og unge mus. Det er således foreslået, at en eller flere processer, der styrer den normale endotel vækst, migration og differentiering er blevet ændret eller elied i denne cellelinie 18. På den anden side, viser morfologiske, immuncytokemiske evaluering af endotel-og BBB markør udtryk, bioelektrisk og paracellulær flux målinger, at vores BBB model cEND er faktisk en egnet model af BBB 19..
Brain endotel in vivo er kendetegnet ved en yderst stram permeabilitet med trans-endotel elektrisk modstand (TEER) rækkende fra 2000-5000 Qcm 2. Til undersøgelser af hjernen mikrovaskulaturen barriereegenskaber til lægemidler, bør paracellulær restrictiveness og tæthed af cellerne overvejes. I de fleste hjernen kapillærendotelceller (BCEC), er dette ikke bevaret som cellerne udviser TEER spænder fra 50 til 100 Wcm 2 20. Den udødeliggjort hjerne endotelceller linje bEnd3 genererer TEER værdier ikke er større end 60 Wcm 2 15. I modsætning differentiering af cEND celler med medium indeholdende reducerede serum displayTEER værdier i området 300-500 Wcm 2 19,21.
Til dato er in vitro-modeller af stretch skade i dyrkede hjerne endotelceller knappe. Derfor kan en in vitro model for traumer gennem stretch skade anvendelse af dyrkede hjerne endotelceller, der fungerer som model for BBB vise sig at være nyttig. I denne protokol, præsenterer vi en in vitro model, der kunne efterligne den faktiske virkning, at hjerneceller, specielt hjernen mikrovaskulære endotelceller fra BBB, modtaget i løbet af TBI. Den vigtigste fordel ved denne model er, at omfanget af den skade påføres celler samt det ekstracellulære miljø kan let kontrolleres på en præcis måde giver nem reproducerbarhed forsøgsopstilling.
Virkningerne af mekanisk skade in vitro er blevet undersøgt og metoder er blevet fastsat for astrocytter, neuroner, gliaceller og aortaendotelceller 8, 9, 22. Der er imidlertid til dato stadig ingen kendt in vitro-model af stræk skade i dyrkede hjerne endotelceller. Cellulære modeller af traumer giver værdifulde fordele i forhold dyremodeller siden mekaniske miljø af cellerne kan styres præcist 6. Derfor, en in vitro model for traumer gennem stretch skade anvendelse af dyrkede endotelceller hjerneceller, der fungerer som model af blod-hjerne-barrieren (BBB) såsom hvad vores protokol gaver kan vise sig at være nyttig.
Denne protokol gør brug af cEND celler, en etableret BBB model i vores laboratorium. Siden BBB-nedbrydning ofte er dokumenteret i TBI patienter og TBI er ofte knyttet til afbrydelse af BBB, som kan føre til ødemdannelse 23, 24, metoden presterede her, kan specifikt anvendes i gennemførelsen BBB studier i forhold til TBI.
I denne model er det vigtigt at tage sig af, hvor meget grad af stræk skade påføres cellerne. For så vidt som cellerne bliver skadet under alle omstændigheder, og med hvad mængden af tryk påføres, adskiller den grad af skade, der kan påvirke endothelceller meget stærkt fra andre celletyper. Aortaendotelceller er mere modstandsdygtige over strække skade end astrocytter eller blandede gliaceller 9. Desuden reparere de mere hurtigt efter skade sammenlignet med de andre celletyper. Derfor er for hjernens endotelceller, navnlig cEND celler, større mængde af stræk skade nødvendig for at producere en høj grad af skade. Man kunne opnå den ønskede grad af skade ved at anvende den tilsvarende tryk angivet i tabel 1.. For cEND celler, der imidlertid alvorlig skade foretrækkes på grund af deres modstand mod stamme. LDH gennemførte assays visteat som graden af stræk stiger, mere LDH udskilles i supernatanten. I modsætning hertil producerede de celler, der fik en lav mængde af stræk skade LDH i en mængde svarende til kontrolceller. Som nævnt i protokollen, skal man passe på, at den passende mængde medium anvendes, da en stigning eller et fald i mængden af mediet kan føre til forskelle i peak tryk, til brøndene. For eksempel registrerer en brønd indeholdende 5 ml væske et trykstød i gennemsnit på 4,0 psi, mens en tom brønd registrerer et gennemsnit på 3,8 psi når 45 psi påføres. Derfor er det bedst at skubbe udløser flere gange over en kontrol samt at sikre, at den maksimale tryk, som vil blive frembragt, svarer til den ønskede mængde.
I vores eksperimenter har vi brugt en levedygtighed plet for at bestemme virkningen af stræk til permeabiliteten af cellemembranen. Optikken i fleksible bund dyrkningsplader brugte vi gør os at b.ew de farvede celler direkte under lup. Men når man ønsker at gennemføre immunolabelling studier direkte efter stræk-skade, kan der opstår vanskeligheder. Først, kan størrelsen og tykkelsen af pladen udgør et problem med nogle mikroskop udsigtsplatforme. For det andet, kan optikken i fleksible membran af brønden være en hindring for at rydde visning.
Trods de ovennævnte begrænsninger, dog kan den beskrevne fremgangsmåde anvendes som en model for in vitro mekanisk skade af BBB. Traumatisk hjerneskade (TBI) omfatter to komponenter, nemlig iskæmi og traumer. Iskæmi kan forekomme som en sekundær skade efter TBI i tilfælde, hvor der er alvorlig blodtab resulterer i lavt blodtryk eller som et resultat af hjerne hævelse begrænse iltforsyning til hjernen. Det betragtes som en forsinket, nonmechanical skader repræsenterer træk patologiske processer igangsat på tidspunktet for skaden 25.. Forekomsten af iltsvind after svær traumatisk hjerneskade er almindeligt 26. Oxygen glucosemangel (OGD) er den metode i øjeblikket anvendes til model iskæmi in vitro. Således kan udsætte celler til OGD som en sekundær fornærmelse til cellerne efter strækning efterligne forekomsten af TBI efterfulgt af iskæmi. Derfor, for at forbedre vores nuværende in vitro model for TBI og mønsteret er det så tæt som muligt til en faktisk TBI som det forekommer in vivo, at vi i fremtiden også vil beskæftige OGD i kombination med stretch skade.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tysk Research Foundation) under tilskud nummer FO 315/4- og Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. HEALTH-F2-2009 til 241.778 til CF.
Cell Injury Controller II | Custom Design and Fabrication, Virginia, USA | http://www.radiology.vcu.edu/research/customdesign/cic.html | ||
Name of Materials | Company | Catalog Number | Remarks | |
Bioflex Culture Plate – Collagen Type I | Flexcell, Dunn Labortechnik | BF – 3001C | ||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | ||
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) | |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C | |
MEM Vitamin | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C | |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | ||
Nonessential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C | |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C | |
Fetal Calf Serum, charcoal stripped (ssFCS) | Life Technologies | 12676-011 | ||
Trypsin-EDTA solution | PAA Laboratories | L11-004 | Storage: ≤ -15 °C | |
Image-iT DEAD Green | Life Technologies | I10291 | Storage: ≤ -15 °C, protected from light | |
Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) | Roche | 4744926001 | Storage: ≤ -15 °C |