Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto
Summary
El trasplante de la célula representa una estrategia para el tratamiento de la degeneración retiniana caracterizada por pérdida del fotorreceptor. Aquí describimos un método para el enriquecimiento de fotorreceptores trasplantables y su injerto subretinal en ratones adultos.
Abstract
La deficiencia visual y la ceguera debidas a la pérdida de las células sensoras de luz de la retina, es decir, los fotorreceptores, representan la principal razón de discapacidad en los países industrializados. El reemplazo de fotorreceptores degenerados por el trasplante de la célula representa una opción posible del tratamiento en usos clínicos futuros. De hecho, los estudios preclínicos recientes demostraron que los fotorreceptores inmaduros, aislados de la retina neonatal del ratón en el día postnatal 4, tienen el potencial de integrarse en la retina adulta del ratón después del trasplante subretinal. Las células dispensadoras de aceite generaron una morfología madura del fotorreceptor incluyendo segmentos internos y externos, un cuerpo de la célula redonda situado en la capa nuclear externa, y terminales sinápticos en gran proximidad a las células bipolares endógenas. De hecho, informes recientes demostraron que los fotorreceptores donantes se integran funcionalmente en los circuitos neuronales de los ratones huésped. Para un uso clínico futuro de tal acercamiento del reemplazo de la célula, las suspensiones purificadas de las células de la opción tienen que ser generadas y ser colocadas en la posición correcta para la integración apropiada en el ojo. Para el enriquecimiento de los precursores de fotorreceptores, la clasificación debe basarse en antígenos específicos de la superficie celular para evitar la modificación genética de las células donantes. Aquí mostramos la clasificación de células asociadas magnéticas (MACS) – enriquecimiento de precursores de fotorreceptores de varilla trasplantables aislados de la retina neonatal de ratones reporteros específicos de fotorreceptores basados en el marcador de superficie celular CD73. La incubación con los anticuerpos anti-CD73 seguidos por los anticuerpos secundarios conjugados micro-grano permitió el enriquecimiento de los precursores del fotorreceptor de la barra por los MACS al aproximadamente 90%. En comparación con la citometría de flujo, macs tiene la ventaja de que puede ser más fácil de aplicar a los estándares GMP y que altas cantidades de células se pueden clasificar en períodos de tiempo relativamente cortos. La inyección de suspensiones de células enriquecidas en el espacio subretinal de ratones adultos de tipo salvaje resultó en una tasa de integración 3 veces mayor en comparación con las suspensiones celulares no clasificadas.
Introduction
La visión es uno de los principales sentidos de los seres humanos. El deterioro de este sentido y la ceguera son una de las principales razones de la discapacidad en los países industrializados. La causa predominante para la debilitación de la visión o la ceguera es la degeneración retiniana, caracterizada por la pérdida de la célula del fotorreceptor, pues puede ser observada en la degeneración macular, el pigmentosa de la retinitis, la distrofia de la cono-barra, y otras condiciones. Hasta la fecha, una terapia eficaz para restaurar la visión perdida no está disponible. En 2006 y 2008 dos laboratorios diferentes reportaron, independientes entre sí, un trasplante exitoso de células precursoras de fotorreceptores de varilla en retinas adultas de ratones de tipo salvaje1,2. Así, surge la posibilidad de trasplante de células precursoras de fotorreceptores también en una retina degenerada, para reemplazar los fotorreceptores degenerados y restaurar la visión. De hecho, se ha demostrado recientemente, que tales células precursoras de fotorreceptores trasplantados provocan criterios morfológicos de fotorreceptores maduros de tipo salvaje, como segmentos externos correctamente desarrollados3,terminales sinápticos en estrecha proximidad a las células bipolares endógenas y un cuerpo de células redondas situado en la capa nuclear externa2-4,así como la capacidad de integrarse funcionalmente en los circuitos neuronales del huésped5-7. Uno de los principios fundamentales de esta estrategia es el uso de retinas de ratones jóvenes postnatales de día 4 (PN 4, PN0 se define como día de nacimiento), lo que resulta en una mezcla de diferentes tipos de células para trasplante. En el fondo de una futura aplicación terapéutica, esta mezcla tiene que ser purificada para las células precursoras de fotorreceptores. CD73 se ha descrito como el primer marcador de superficie celular específico para fotorreceptores jóvenes en la retina8-10. Aquí, se demuestra un método de purificación de células precursoras de fotorreceptores basado en este marcador de superficie celular y con el uso de la técnica de clasificación de células asociadas magnéticamente (MACS). Macs podría tener ventajas en comparación con las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescentes, debido a los tiempos de clasificación rápidos y el ajuste más fácil a las condiciones GMP. Podríamos demostrar un enriquecimiento del ~90% y un índice más alto de la integración del hasta 3 dobleces al trasplantar la población enriquecida al espacio subretinal en el salvaje-tipo adulto retinas. Así, el enriquecimiento macs-basado de la célula del precursor del fotorreceptor y el trasplante subretinal, son técnicas confiables y prometedoras para el desarrollo de una estrategia terapéutica regenerativa para el tratamiento de la degeneración retiniana.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trasplante subretiniano de células precursoras de fotorreceptores representa una herramienta confiable para lograr la integración de estas células sensibles a la luz en las retinas del huésped en números significativos1,2. Esto podría permitir el establecimiento de una terapia celular para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en el futuro6. La población donante de células, actualmente aislada de las retinas PN 4, es una mezcla de diferentes tipos de células, de las que sólo las células…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gusta agradecer a Anand Swaroop por proporcionar ratones Nrl-GFP, Jochen Haas por soporte técnico y Sindy Böhme y Emely Lessmann por la cría de animales.
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 – Center of Regenerative Therapies Dresden, el CRTD Seed Grant Program, el SFB 655 y el ProRetina e.V. fundación, el DIGS-BB Graduate Program Dresden, y la Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
Materials
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | supplied DNase I is not used in the method |
| purified rat anti-mouse CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Stock concentration 0.5mg/ml |
| Goat Anti-Rat IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Total volume of 2ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to count the total number of cells |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | – |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Used for dissociation of the retinas |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Used to count the total number of cells |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | – | – |
| Domitor | Pfizer | 76579 | – |
| Ketamin 10% | Ratiopharm | 7538843 | – |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | – |
| Phenylephrin 2.5%-Tropicamid 0.5% | University clinics Dresden pharmacy | – | – |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Pre-Separation Filters | Miltenyi | 130-041-407 | – |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | – |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | – |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi | 130-090-976 | – |
| fire polish glass pasteur pipette | Brand | 74777 20 | The pipette’s tips need to be fire-polished and autoclaved. |
| MACS 15ml tube rack | Miltenyi | 130-091-052 | – |
| Cell count chamber | Carl Roth | T728.1 | – |
| Sterile 15ml tubes | Greiner Bio-one | 188271 | – |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | can be used instead of Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | Olympus | SZX10 | can be used instead of Leica M651 MSD |
| Olympus inverted stereo microscope CKX41 | Olympus | CKX41 | – |
| Cell culture hood Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo scientific | 51025411 | – |
| 1.5ml reaction tube | Sarstedt | 727706400 | – |
| 2ml reaction tube | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | – |
| Mouse head holder | myNeurolab | 471030 | – |
| BD Microlance 3 30G 1/2” | BD Pharmingen | 304000 | – |
| Hamilton microliter syringe 5µl, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | delivered without needles |
| Hamilton RN special needle GA34 | Hamilton | 065-207434 | Blunt, 12mm length |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – 5mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15003-08 | – |
| Dumont #7 Forceps – Titanium Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | – |
| Diamond pen | Tools-tech | – | – |
| 15x15mm Cover slips | Sparks | MIC3366 | – |
Riferimenti
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