मानव सीरम में एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर या dopamine का 2 रिसेप्टर के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए उच्च throughput फ्लो सेल आधारित परख
Summary
हाल के वर्षों में, लाइव सेल आधारित assays सतह और गठनात्मक एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. यहाँ, हम रोगियों की बड़ी साथियों के विश्लेषण सक्षम cytometry उच्च throughput प्रवाह का उपयोग कर एक विधि का वर्णन. उपन्यास एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए प्रतिरक्षा की मध्यस्थता से जुड़ी समस्याओं के निदान और उपचार में सुधार होगा.
Abstract
हाल के वर्षों में, सतह और neurotransmission में शामिल गठनात्मक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी बच्चों और वयस्कों में autoimmune सीएनएस रोगों में खोजा गया है. ये एंटीबॉडी निदान और उपचार के लिए गाइड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. सेल आधारित assays रोगी सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने में सुधार हुआ है. वे तो fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा पतला रोगी सीरा के साथ incubated हैं जो कोशिकाओं पर मस्तिष्क एंटीजन, की सतह अभिव्यक्ति पर आधारित हैं. धोने के बाद, बाध्यकारी माध्यमिक एंटीबॉडी तो फ्लो से विश्लेषण किया है. हमारे समूह मज़बूती से विशिष्ट neurotransmitter रिसेप्टर्स के खिलाफ एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लाइव सेल आधारित परख cytometry एक उच्च throughput प्रवाह विकसित की है. इस फ्लो विधि सीधे आगे, मात्रात्मक, कुशल है, और बड़े रोगी साथियों को आसानी से समय की एक छोटी जगह में assayed हो के लिए एक उच्च throughput नमूना प्रणाली का प्रयोग अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, इस रूप में सेल आधारितकहने आसानी से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र और परिधि से दोनों कई अलग अलग प्रतिजनी लक्ष्य के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. अतिरिक्त उपन्यास एंटीबॉडी बायोमार्कर की खोज शीघ्र और सही निदान सक्षम और प्रतिरक्षा की मध्यस्थता विकारों के उपचार में सुधार होगा.
Introduction
हाल के वर्षों में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) रोगों के autoimmune रूपों की पहचान की गई है. यह इन बीमारियों जुड़े और autoantibodies की उपस्थिति द्वारा परिभाषित कर रहे हैं कि दिखाया गया है. ये एंटीबॉडी neuronal रिसेप्टर्स या neurotransmission 1,2 में शामिल synaptic प्रोटीन के लिए बाध्य. विभिन्न एंटीजन ऐसी एन मिथाइल-D-aspartate रिसेप्टर (NMDAR) 3-5, γ-aminobutyric एसिड बी रिसेप्टर (GABA बी) रिसेप्टर 6, α-अमीनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-, के रूप में खोजा गया है isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर 7, वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल (VGKC) जुड़े प्रोटीन: leucine संपन्न glioma सक्रिय 1 प्रोटीन (LGL -1) और contactin जुड़े प्रोटीन 2 (capsr2) 8,9, ग्लूटामेट रिसेप्टर 5,10 , और डोपामाइन -2 रिसेप्टर (D2R) 11. अतीत में, (मुख्य रूप से इन्सेफेलाइटिस कहा जाता है) इन autoimmune सीएनएस विकारों अक्सर undiagnosed और अनुपचारित थे. ये उपन्यास एंटीबॉडी बायोमार्कर, उदाNMDAR एंटीबॉडी या D2R एंटीबॉडी, काफी हद तक निदान और जागरूकता में सुधार हुआ है, और रोगियों के लिए उपचार के विकल्प खोल दिया है. दरअसल, immunotherapies के साथ जल्दी इलाज बेहतर परिणाम 11,12 के साथ जुड़ा हुआ है.
ऐसे एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) और पश्चिमी धब्बा के रूप में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए पारंपरिक तरीकों के सेरा में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, वे आसानी से बाह्य या सतह epitopes की मान्यता सक्षम नहीं है और, बल्कि, एक intracellular मिलान की ओर immunoreactivity प्रकट हो सकता है. इसके अलावा, neurotransmission में शामिल महत्वपूर्ण प्रोटीन की कोशिकी डोमेन के लिए बाध्य एंटीबॉडी कि रोगजनक 2,3,7,13,14 होने की संभावना है. इसलिए, प्रासंगिक कोशिका की सतह या रोगियों में बाह्य एंटीबॉडी लक्ष्य की खोज करने के लिए सही और संवेदनशील assays के विकास सर्वोपरि है. क्षेत्र में सोने के मानक विधि तथाकथित "सेल में बीए, जीवित कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित हैSED assays ". इस विधि स्तनधारी कोशिकाओं ब्याज की प्रतिजन की पूरी सीडीएनए अनुक्रम युक्त वैक्टर के अभिकर्मक द्वारा अपने मूल रूप में (सबसे अधिक बार मानव भ्रूण गुर्दे 293 (HEK293) कोशिकाओं) की सतह पर एक प्रतिजन की अभिव्यक्ति शामिल है. लाइव nonpermeabilized कोशिकाओं तो पतला रोगी सीरम के साथ incubated और fluorochrome संयुग्मित विरोधी मानव इम्युनोग्लोबुलिन (आईजी) माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति की तीव्रता या स्तर तो पता चला है और बाध्यकारी स्वप्रतिरक्षी के स्तर पर जुड़ा हुआ है. केवल एक प्रतिजन कोशिकाओं में overexpressed है के रूप में इस तकनीक, विशिष्ट है. सबसे व्यापक रूप से "पढ़ने के लिए बाहर" का इस्तेमाल immunocytochemistry 4,5,8-10 बाद confocal माइक्रोस्कोपी विश्लेषण किया गया है. हालांकि, सेल आधारित assays प्रवाह cytometry सफलतापूर्वक demyelinating रोगों 15-17 के साथ रोगियों में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. विशेष रूप से, जल एट अल. 15 एक पैन का उपयोग एंटीबॉडी का पता लगाने की तुलनासेल आधारित माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा assays या प्रवाह सहित एंटीबॉडी का पता लगाने की तकनीक का El cytometry विश्लेषण करती है, और सबसे संवेदनशील सटीक और विश्वसनीय तरीका हो सेल आधारित परख प्रवाह cytometry दिखाया गया है. यह अन्वेषक निर्भर, मात्रात्मक नहीं है, और रेडियोधर्मी सामग्री के किसी भी इस्तेमाल को शामिल नहीं करता है के रूप में इसलिए, सेल आधारित परख प्रवाह cytometry फायदेमंद है. यह बड़े रोगी साथियों समय की एक छोटी राशि में assayed की अनुमति देता है के रूप में यह भी सुविधाजनक है.
हाल ही में, हम autoimmune सीएनएस बीमारियों 11 के साथ रोगियों में NMDAR एंटीबॉडी और D2R एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए सेल आधारित परख cytometry एक उच्च throughput प्रवाह अनुकूलित है. हमारे समूह ने हाल ही में सेल आधारित परख प्रवाह cytometry का उपयोग रोगी सीरा में NMDAR एंटीबॉडी का पता चला. ये NMDAR एंटीबॉडी पॉजिटिव सीरा पहले confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण किया गया है और यह भी 11 पॉजिटिव पाए गए. इस प्रोटोकॉल सी का पता लगाने के लिए सेल आधारित परख cytometry एक प्रवाह की रूपरेखाएक स्वचालित उच्च throughput पारखी उपयोग रोगी सीरम में onformation संवेदनशील सीएनएस एंटीबॉडी.
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पत्र एक उच्च throughput पारखी का उपयोग विशेष सेल सतह neuronal प्रोटीन का लक्ष्य एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लाइव सेल आधारित परख प्रवाह cytometry का एक उपन्यास आवेदन का वर्णन करता है. इस तकनीक का उपयोग करना, हम autoimmune सीएन…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद, स्टार वैज्ञानिक फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया), Tourette सिंड्रोम एसोसिएशन (यूएसए) द्वारा समर्थित किया गया था, ट्रिश मल्टीपल स्केलेरोसिस अनुसंधान फाउंडेशन और मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च ऑस्ट्रेलिया, Petre फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया), रेबेका एल कूपर मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन (ऑस्ट्रेलिया). हम सभी रोगियों और हमारे अध्ययन के लिए नमूने उपलब्ध कराए गए हैं, जो परिवार के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
Riferimenti
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
