その時 液体中の生物学的集合体のTEM
Summary
ここでは、透過型電子顕微鏡を用いて、ナノメートル分解能でウイルス複合体を画像化する手順について説明する。
Abstract
研究者は定期的に透過電子顕微鏡(TEM)を使用して生物学的実体を調べ、新しい材料を評価します。ここでは、液体環境でのウイルスアセンブリの表示- これらの機器のための追加のアプリケーションを説明します。この新しい生物学的構造の可視化手法は、最近開発されたマイクロ流体ベースの検体ホルダーを利用しています。ビデオ記事では、TEM内の液体標本を画像化するためにマイクロ流体ホルダーを組み立てて使用する方法を示しています。特に、モデルシステムとしては、シミアンロタウイルスの二重層粒子(DMP)を用います。また、DDLPsを視受窓につなげたアフィニティバイオフィルムで液体チャンバーの表面をコーティングする手順についても説明する。これにより、3D構造の決定に適した方法でアセンブリをイメージすることができます。このように、我々は、天然の液体環境における亜ウイルス粒子の最初の一見を提示する。
Introduction
生物学者や技術者の共通の目標は、分子機械の内部の仕組みを理解することです。透過型電子顕微鏡(TEM)は、原子に近い分解能1~2でこれらの複雑な細部を可視化するのに理想的な装置です。TEMの高真空システムを維持するために、生体試料は、典型的には、ビトレウス氷3の薄膜に埋め込まれ、糖4、重金属塩5、またはそれらの組み合わせ6が挙げられる。その結果、埋め込み標本の画像は、動的プロセスの限られたスナップショットのみを明らかにすることができる。
環境液体室で水和した生物学的標本を維持する初期の試みは、パーソンズと同僚が差動ポンプステージを使用して行った。未染色カタラーゼ結晶の電子回折パターンは、水和状態で3Åの分解能に記録された7-8.さらに、相分離脂質ドメインは、ヒト赤血球9〜10の水和膜で調べることができた。しかし、液体の拡散や電子線との干渉による運動は、重度の分解能損失をもたらし、生物学的標本を用いたさらなる実験は最近まで試みられなかった。
半導体マイクロチップを利用してマイクロスケール環境室を形成する新開発のマイクロ流体試料ホルダーが導入されました。これらのデバイスは、TEM 列11 から 12に配置されている間、サンプルを液体に保持できます。TEMイメージングにおけるこの技術的ブレークスルーにより、研究者は分子レベル13で初めて進行性のイベントを見ることを可能にしました。この新しいモダリティを「その時点での 分子顕微鏡」と呼び、EMカラム14-15の「内部」で実験を行うことができるようになりました。この方法の全体的な目的は、ナノメートル解像度でのそれらの動的挙動を観察するために液体中の生物学的アセンブリを画像化することです。開発された技術の背後にある根拠は、リアルタイムの観測を記録し、溶液中の生物学的機械の新しい特性を調べることです。この方法論は、細胞生物学および分子生物学におけるより広範な目的のためのTEMの使用を拡大する 12-16.
現在のビデオ記事では、市販のマイクロ流体標本ホルダーを組み立て、使用するための包括的なプロトコルを紹介しています。これらの専門のホルダーは、溶液の微細なボリュームを囲む液体チャンバーを形成するために、統合されたスペーサーで製造されたシリコン窒化マイクロチップを利用します。薄く透明な窓は、撮像目的のためにマイクロチップにエッチングされる12。TEMを用いて、マイクロ流体ホルダーを用いて、液体中のシミアンロタウイルス二重層粒子(DRP)を調べるのが適切な方法を示す。DMPなどの生物学的アセンブリがイメージング中に遠距離で急速に拡散しないようにするために、我々は、それらをマイクロ流体室16の表面にテザーするためにアフィニティキャプチャアプローチを採用する。この分子捕獲ステップは下流の処理ルーチンに使用されるイメージの獲得を可能にするので液体の生物学的標本をイメージするための 代替技術より大きな利点 がある。マイクロ流体イメージングと組み合わせて使用されるこのキャプチャステップは、当社の手順17に固有です。TEMまたはマイクロ流体イメージングチャンバを使用して構造生物学アプリケーションを採用している読者は、分子レベルでの動的観測が最終目標である場合、アフィニティーキャプチャ技術の使用を検討することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
今回の研究では、テザーロタウイルスDMPに対するアフィニティキャプチャアプローチをマイクロ流体プラットフォームに採用しました。これは、液体微小環境における高分子複合体の画像化をその 場 で可能にした。キャプチャアプローチは、生物学的標本をイメージングウィンドウに局地化して、液体中の画像を記録している間に発生する大きな拡散性の問題を否定するため、 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、バージニア工科大学カリリオン研究所所長のマイケル・J・フリードランダー博士が研究努力を奨励することを認めている。このプロジェクトは、S.M.MとD.F.K.への開発資金と、バージニア工科大学の重要技術応用科学研究所のナノバイオイニシアチブによって支えられました。
Materials
| E-chips, spacer chip | Protochips, Inc. | EPB-52TBD | 400 μm x 50 μm window |
| E-chip, top chip | Protochips, Inc. | EPT-45W | 400 μm x 50 μm window |
| Ni-NTA lipid | Avanti Polar Lipids | 790404P | Powder form |
| DLPC (12:0) lipid | Avanti Polar Lipids | 850335P | Powder form |
| Volumetric flasks | Fisher Scientific | 20-812A; 20-812C | 1 ml; 5 ml |
| Hamilton Syringes | Hamilton Co. | 80300, 80400 | 1-10 μl; 1-25 μl |
| Whatman #1 filter paper | Whatman | 1001 090 | 100 pieces, 90 mm |
| Glass Petri dishes | Corning | 70165-101 | 100 mm x 15 mm |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-010 | 14673-010 |
| Glass culture tubes | VWR | 47729-566 | 6 mm x 50 mm |
| Acetone | Fisher Scientific | A11-1 | 1 L |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | 1 L |
| Chloroform | Electron Microcopy Sciences | 12550 | 100 ml |
| His-tagged Protein A | Abcam, Inc. | ab52953 | 10 mg |
| Milli-Q water system | EMD Millipore Corp. | Z00QSV001 | Ultrapure Water |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | 500 g |
| Equipment | |||
| Poseidon In situ specimen holder | Protochips, Inc. | FEI compatible | |
| FEI Spirit BioTwin TEM | FEI Co. | 120 kV | |
| Eagle 2k HS CCD camera | FEI Co. | 10 Å/pixel sampling at 30,000X | |
| Gatan 655 Dry pump station | Gatan, Inc. | Pump holder tip to 10-6 range | |
| PELCO easiGlow, glow discharge unit | Ted Pella, Inc. | Negative polarity mode | |
| Isotemp heated stir plate | Fisher Scientific | Heat to 150 ºC for 1.5 hr |
Riferimenti
- Zhou, Z. H. Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).
- Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Subunit interactions in bovine papillomavirus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).
- Unwin, P. N., Henderson, R. Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens. J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).
- Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. . Negative Staining and Image Classification – Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).
- Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. Cryo-negative staining. Micron. 29, 145-160 (1998).
- Parsons, D. F. Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily. Science. 186, 407-414 (1974).
- Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects. Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F. Electron diffraction of wet biological membranes. Science. 184, 77-78 (1974).
- Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. Electron diffraction of wet phospholipid bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).
- Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. Transmission electron microscopy with a liquid flow cell. J. Microsc. 242, 117-123 (2011).
- Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy. Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).
- Gilmore, B. L., et al. Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere. Lab Chip. 13, 216-219 (2013).
- Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. Purification and characterization of bovine rotavirus cores. J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).
- Frank, J., et al. SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, X., et al. Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).
- Scheres, S. H. A Bayesian view on cryo-EM structure determination. J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).
- Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification. J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).
