वी 3 वर्कफ्लो दाग मुक्त जैल का उपयोग करके एक पश्चिमी दाग प्रक्रिया है। दाग मुक्त प्रौद्योगिकी शोधकर्ताओं को प्रोटीन जुदाई की गुणवत्ता की कल्पना करने की अनुमति देता है, हस्तांतरण दक्षता को सत्यापित करने के लिए, और सबसे महत्वपूर्ण बात, एक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण के रूप में कुल प्रोटीन मात्राकरण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन में परिवर्तन को मान्य करने के लिए ।
पश्चिमी दाग एक बहुत ही उपयोगी और व्यापक रूप से अपनाई गई प्रयोगशाला तकनीक है, लेकिन इसका निष्पादन चुनौतीपूर्ण है। वर्कफ़्लो को अक्सर “ब्लैक बॉक्स” के रूप में चित्रित किया जाता है क्योंकि एक प्रयोगवादी को पता नहीं होता है कि इसे कई चरणों के आखिरी तक सफलतापूर्वक किया गया है या नहीं। इसके अलावा, पश्चिमी दाग डेटा की गुणवत्ता को कभी-कभी पश्चिमी ब्लॉटिंग प्रक्रिया में प्रभावी गुणवत्ता नियंत्रण उपकरणों की कमी के कारण चुनौती दी जाती है। यहां हम V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं, जो पारंपरिक पश्चिमी दाग प्रोटोकॉल से जुड़ी प्रमुख चिंताओं को दूर करने के लिए दाग मुक्त तकनीक लागू करता है। यह कार्यप्रवाह शोधकर्ताओं को अनुमति देता है: 1) लगभग 20-30 मिनट में एक जेल चलाने के लिए; 2) जेल चलाने के बाद 5 मिनट के भीतर नमूना जुदाई गुणवत्ता की कल्पना करने के लिए; 3) 3-10 मिनट में प्रोटीन स्थानांतरित करने के लिए; 4) हस्तांतरण दक्षता को मात्रात्मक रूप से सत्यापित करने के लिए; और सबसे महत्वपूर्ण बात 5) कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मान्य करने के लिए। यह उपन्यास दृष्टिकोण β-ऐक्टिन, β-ट्यूबलिन, गपध आदि जैसे हाउसकीपिंग प्रोटीन के लिए दाग को अलग करने और फिर से लागू करने की आवश्यकता को समाप्त करता है । V3 दाग मुक्त कार्यप्रवाह पश्चिमी दाग प्रक्रिया को तेज, पारदर्शी, अधिक मात्रात्मक और विश्वसनीय बनाता है ।
पश्चिमी दाग एक बहुत ही उपयोगी तकनीक है9,हालांकि, पश्चिमी ब्लॉटिंग के साथ दो प्रमुख चुनौतियां हैं: लंबी और श्रम गहन प्रक्रिया और डेटा की गुणवत्ता। एक पारंपरिक प्रोटोकॉल के बारे में 2 दिनों की आवश्यकता है। इसमें नमूना तैयारी, जेल कास्टिंग, प्रोटीन इलेक्ट्रोफोरेसिस और स्थानांतरण, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन, इमेजिंग, और अक्सर अलग करना, पुनर्प्राण और अंत में डेटा विश्लेषण के बाद झिल्ली अवरुद्ध सहित कई कदम शामिल हैं। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रक्रिया नियंत्रण के लिए कोई विश्वसनीय और लचीला उपकरण नहीं हैं। जैसे, त्रुटियों को प्रत्येक चरण में पेश किया जा सकता है, और इन त्रुटियों में डेटा कलाकृतियों को उत्पन्न करने की क्षमता है; इसलिए, त्रुटियों की पहचान करने और सही करने के लिए पश्चिमी ब्लॉटिंग में लोडिंग नियंत्रण आवश्यक हैं। लोडिंग नियंत्रण आमतौर पर प्रत्येक नमूने में एक संदर्भ प्रोटीन के प्रोटीन स्तर की जांच करके किया जाता है ताकि यह देखा जा सके कि क्या इसे समान रूप से प्रस्तुत किया गया है। लोग अक्सर लोडिंग कंट्रोल के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन जैसे β-ऐक्टिन, β-ट्यूबलिन, गपध का इस्तेमाल करते हैं।
पश्चिमी दाग डेटा की गुणवत्ता विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण पर निर्भर करता है। लेकिन लोडिंग नियंत्रण के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करते समय दो वैध चिंताएं हैं: 1) हाउसकीपिंग प्रोटीन बैंड का एंटीबॉडी-आधारित इम्यूनोडेटेक्शन अक्सर संतृप्त होता है और इसलिए कोई भी नमूनों के बीच लोडिंग मतभेदों को अलग नहीं कर सकता30; 2) हाउसकीपिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर कुछ प्रायोगिक परिस्थितियों में नमूनों में भिन्न हो सकता है,उदाहरण के लिए, सिरना उपचार, सेल डेथ, सेल भेदभाव, आदि11,28,3,6,10,21। इन चिंताओं के कारण, वैज्ञानिक पत्रिकाओं को अब यह आवश्यकता होती है कि “मात्रात्मक तुलना के लिए, उचित अभिकर्षक, नियंत्रण और रैखिक सिग्नल पर्वतमाला के साथ इमेजिंग विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए” (नेचर दिशानिर्देश)। इसी तरह, जर्नल ऑफ क्लीनिकल इन्वेस्टिगेशन के संपादक अधिक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण24की मांग कर रहे हैं । इन कारणों से, लोडिंग नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने के लिए हाउसकीपिंग प्रोटीन को मान्य करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि इसे इम्यूनोडेटेक्शन विधि14,29की रैखिक गतिशील रेंज में मापा जाता है। दूसरा, किसी को यह सुनिश्चित करना होगा कि यह सभी नमूनों में लगातार व्यक्त किया जाता है26,31,25,19,20।
एक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण का एक वैकल्पिक समाधान दाग से कुल प्रोटीन माप का उपयोग करना है। कुछ शोधकर्ताओं ने कुल प्रोटीन दाग के साथ दाग दाग, जैसे Coomassie, राजहंसो गुलाबी, Sypro रूबी, Amido काले, Ponceau एस, और दाग मुक्त प्रौद्योगिकी, लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रत्येक लेन में कुल प्रोटीन संकेत को मापने के लिए16,20,13,27,1,4,12। कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण हाउसकीपिंग प्रोटीन से जुड़े नुकसान से बचा जाता है। सबसे पहले, यह प्रत्येक नमूने के लिए लोड प्रोटीन की मात्रा का एक सच्चा प्रतिबिंब है। दूसरा, कुल प्रोटीन दाग पश्चिमी दाग विश्लेषण (एक जटिल कोशिका lysate के 10-50 μg प्रोटीन) के लिए आम लोडिंग रेंज में उत्कृष्ट रैखिक गतिशील रेंज प्रदर्शित करता है और सही नमूनों के बीच लोडिंग अंतर को अलग करता है12।
दाग मुक्त तकनीक एक उपन्यास कुल प्रोटीन धुंधला विधि है जहां एक अद्वितीय यौगिक एक्रिलैमाइड जेल समाधान में मिलाया जाता है और समान रूप से कास्ट जेल में वितरित किया जाता है। इलेक्ट्रोफोरेसिस पूरा होने के बाद, जेल को कम से कम 1 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है ताकि दाग यौगिक प्रोटीन में ट्राइप्टोफन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया करता है। प्रोटीन यूवी प्रकाश के तहत उत्तेजनीय हो जाते हैं ताकि एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत दिया जा सके जिसे केमिडोक एमपी सिस्टम जैसे दाग-मुक्त सक्षम इमेजर में कल्पना और मात्रात्मक किया जा सकता है। दाग मुक्त यौगिक ही, हालांकि, यूवी प्रकाश को अवशोषित नहीं करता है, जिसके परिणामस्वरूप जेल छवि की पृष्ठभूमि कम होती है। ट्रिप्टोफान अवशेषों का संशोधन अपरिवर्तनीय है और प्रोटीन को न केवल जेल में बल्कि प्रोटीन हस्तांतरण के बाद किसी भी समय दाग पर भी कल्पना की जा सकती है।
दाग मुक्त प्रौद्योगिकी V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह(चित्रा 1)में लागू किया जाता है पारंपरिक कार्यप्रवाह के बारे में प्रमुख शिकायतों को संबोधित करने के लिए, विशेष रूप से लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करने के साथ चिंताओं । इस कार्यप्रवाह का उपयोग करके, एक सकता है: 1) जेल चलाने के बाद 5 मिनट में नमूना अखंडता और प्रोटीन पृथक्करण गुणवत्ता की जांच करें; 3) 3-10 मिनट में प्रोटीन स्थानांतरित; 4) हस्तांतरण दक्षता मात्रात्मक रूप से जांचें; और 5) सबसे महत्वपूर्ण बात, कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग कर ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन मान्य।
ऊपर वर्णित V3 दाग मुक्त प्रोटोकॉल मल्टीप्लेक्सिंग फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉटिंग के लिए है। यह भी केमिल्यूमिनेसेंट का पता लगाने का उपयोग कर पश्चिमी दाग में लागू किया जा सकता है। मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट वेस्टर्न ब्लॉट प्रोटोकॉल में, दाग मुक्त दाग छवियों को दो समय बिंदुओं पर प्राप्त किया जाता है: 1) प्रोटीन हस्तांतरण के ठीक बाद; 2) एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के बाद मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इमेजिंग स्टेप पर। पहली दाग मुक्त छवि हस्तांतरण दक्षता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है और दूसरी दाग मुक्त छवि लोडिंग नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। जब केमिल्यूमिनेसेंट विधि लागू की जाती है, तो दाग मुक्त और लक्षित प्रोटीन संकेतों के लिए मल्टीप्लेक्स छवि लेना संभव नहीं है, क्योंकि केमिल्यूमिनेसेंट सिग्नल दाग मुक्त चैनल में भी दिखाई देगा। इस मामले में, हम लोडिंग नियंत्रण और सामान्यीकरण विश्लेषण के लिए प्रोटीन हस्तांतरण कदम के ठीक बाद ली गई दाग मुक्त छवि का उपयोग करने की सलाह देते हैं।
V3 पश्चिमी वर्कफ्लो पारंपरिक पश्चिमी दाग वर्कफ़्लो की तुलना में निम्नलिखित अद्वितीय लाभ प्रदान करता है जो लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करता है:
सबसे पहले, V3 कार्यप्रवाह ब्याज के प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन को मान्य करने के लिए एक व्यावहारिक, सुविधाजनक और अधिक विश्वसनीय लोडिंग नियंत्रण प्रदान करता है। V3 प्रोटोकॉल प्रत्येक नमूने में मापा ब्याज के प्रोटीन के स्तर को सामान्य करने के लिए कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण का उपयोग करता है। यह लोडिंग नियंत्रण के रूप में हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग करने के दो नुकसान से बचा जाता है: संतृप्त इम्यूनोडेटेक्शन और कुछ प्रायोगिक परिस्थितियों में नमूनों के बीच असंगत हाउसकीपिंग प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर। हाउसकीपिंग के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के साथ अलग करना और पुनर्प्राण कदम अब आवश्यक नहीं है। दाग मुक्त तकनीक का उपयोग करके, कुल प्रोटीन माप के लिए कूमासी या सिप्रो रूबी जैसे दागों के साथ दाग और दाग को दागने की कोई आवश्यकता नहीं है। इमेज लैब सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कुल प्रोटीन सामान्यीकरण करने के लिए एक दाग छवि प्राप्त करने में कुछ सेकंड लगते हैं और लगभग 5 मिनट।
दूसरा, V3 कार्यप्रवाह वैज्ञानिकों को पश्चिमी प्रक्रिया का बेहतर नियंत्रण लेने की अनुमति देता है क्योंकि यह प्रक्रिया को अधिक पारदर्शी बनाता है और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए कई चौकियों का परिचय देता है । दाग मुक्त तकनीक की मदद से शोधकर्ता जेल और दाग दोनों पर अपने प्रोटीन के नमूनों की कल्पना कर सकते हैं । वैज्ञानिक प्रोटीन नमूना अखंडता (अपमानित या नहीं), जुदाई गुणवत्ता (उपजी या नहीं), हस्तांतरण दक्षता और हस्तांतरण गुणवत्ता (यहां तक कि हस्तांतरण या नहीं) का आकलन कर सकते हैं । ये चौकियां इस प्रक्रिया में बड़ी खामियों को देखते समय शोधों को प्रयोग समाप्त करने में मदद करती हैं और खराब नमूनों और दाग पर समय बर्बाद करने से बचते हैं। यह तकनीक वैज्ञानिकों को यह आकलन करने में भी मदद करती है कि झिल्ली अलग करने के बाद प्रोटीन की कमी हुई है या नहीं और क्या यह दाग एक अलग लक्ष्य 4को फिर से तैयार करने के लिए उपयुक्त है ।
V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह का उपयोग करके अच्छे अनुभव और गुणवत्ता वाले डेटा को सुनिश्चित करने के लिए यहां कुछ सुझाव दिए गए हैं।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यूवी-एक्टिवेशन के बाद दाग मुक्त अणु अपरिवर्तनीय रूप से ट्राइप्टोफन अवशेषों के लिए बाध्य है। यह अपरिवर्तनीय संशोधन संभावित रूप से एंटीजन मान्यता को प्रभावित कर सकता है जब मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके यदि एपिटोप में ट्रिप्टोफान होता है। पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी प्रभावित होने की संभावना नहीं है क्योंकि वे एंटीजन पर कई एपिटोप को पहचानते हैं। अनबाउंड दाग मुक्त अणुओं को आसानी से जेल और झिल्ली से धोया जाता है और इसलिए एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन में हस्तक्षेप नहीं करेगा।
अंत में, V3 पश्चिमी कार्यप्रवाह पश्चिमी दाग प्रक्रिया को तेज, अधिक पारदर्शी, मात्रात्मक और अधिक विश्वसनीय बनाता है। शोधकर्ता अब आसानी से अपने डेटा को और अधिक भरोसेमंद बनाने के लिए एक पश्चिमी दाग प्रयोग में कुल प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण लागू कर सकते हैं । V3 दाग मुक्त कार्यप्रवाह प्रयोगशालाओं के एक नंबर द्वारा अपनाया गया है, और उनके प्रकाशनों का प्रदर्शन किया है कि पत्रिकाओं पश्चिमी दाग22,17,7,8,5,23,18,15में लोडिंग नियंत्रण के रूप में दाग मुक्त डेटा स्वीकार करते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ वुल्फ-डाइटर स्टैल्ज, डॉ अरनॉड रेमी, डॉ एंटोन पोच, डॉ पेट्रीसिया पित्ती, टॉम डेविस, किरिस सिमोयी और जेफ डरबन को इस पांडुलिपि की आलोचनात्मक समीक्षा और संपादन के लिए धन्यवाद देते हैं । लेखक भी तकनीकी सहायता के लिए एलीसन श्वार्ट्ज का शुक्रिया अदा करते हैं ।
REAGENTS | |||
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel | Bio-Rad | 567-8093 | Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment |
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 170-4157 | Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size |
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml | Bio-Rad | 170-5061 | |
[header] | |||
EQUIPMENT | |||
Criterion Cell | Bio-Rad | 165-6100 | |
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System | Bio-Rad | 170-4155 | |
ChemiDoc MP System | Bio-Rad | 170-8280 |