En qPCR analys utvecklades för detektion av Escherichia coli O157: H7 riktar en unik genetisk markör, Z3276. Den qPCR kombinerades med propidium monoazide (PMA) behandling för levande cell upptäckt. Detta protokoll har ändrats och anpassats till en 96-brunnar format för enkel och konsekvent hantering av många prover
En unik öppen läsram (ORF) Z3276 identifierades som en särskild genetisk markör för E. coli O157: H7. En qPCR analys utvecklades för detektion av E. coli O157: H7 genom att rikta ORF Z3276. Med denna analys, kan vi upptäcka så lite som några få kopior av genomet av DNA av E. coli O157: H7. Känsligheten och specificiteten hos analysen bekräftades genom intensiva valideringstester med ett stort antal E. coli O157: H7-stammar (n = 369) och icke-O157-stammar (n = 112). Dessutom har vi kombinerat förfarande propidium monoazide (PMA) med den nyutvecklade qPCR protokoll för selektiv detektering av levande celler från döda celler. Amplifiering av DNA från PMA-behandlade döda celler var nästan helt inhiberade i motsats till nästan opåverkad amplifiering av DNA från PMA-behandlade levande celler. Dessutom har det protokoll som modifierats och anpassats till ett 96-brunnsplattformat för en enkel och konsekvent hantering av ett stort antal prover. Thans metod förväntas påverka korrekt mikrobiologiska och epidemiologisk övervakning av livsmedelssäkerheten och miljö källa.
PCR är en vanlig teknik för detektion av E. coli O157: H7 från mat-och miljöprover. Identifiering av specifika biomarkörer för E. coli O157: H7 är en av de viktigaste faktorerna för framgångsrik detektering i PCR-analyser. De biomarkörer som vanligen användes i PCR-analyser för detektion av E. coli O157: H7 inkluderar Shiga toxiner (STX 1 och STX 2) 1,2, uidA 3,4, EAEA 5,6, rfbE 7, och flic gener 8,9. Dessa markörer kan ge variabel effektivitet för identifiering, men de flesta av de biomarkörer kan inte användas som en unik biomarkör för detektering av E. coli O157: H7. Denna otillräcklighet i differentiering makt målgener kräver mer specifik och starkare biomarkör (ar) för identifiering av E. coli O157: H7 10.
Talrika prober för gener eller hypotetiska öppna läsramar (ORF) i E. coliO157: H7 11 utformades för qPCR analys baserad på ledtrådar från DNA-genotypning microarrays från vårt laboratorium och genom att söka i databasen GenBank av National Center for Biotechnology Information. Sekvensen hos Z3276 ORF, som är ett fimbrialt gen 11, valdes för qPCR assay. Därefter gjordes en qPCR analys utvecklats genom många prövningar av PCR-parametrar såsom koncentrationer av primers och prober, samt glödgning och förlängningstemperaturer (data visas ej). Efter incitament integrering och exklusivitet tester på referensstammar såsom E. coli O157: H7, non-O157 och Shigella-stammar i qPCR, var ORF Z3276 identifieras som en specifik och stark genetisk markör för identifiering av E. coli O157: H7. Sedan utvecklar vi en ny qPCR metod att använda denna unika biomarkör för identifiering av E. coli O157: H7.
En annan utmaning i upptäckt av E. coli O157: H7 i förorenat foods och miljö är noggrann bestämning av levande celler från prover. Den utökade närvaron av DNA från döda celler och oförmåga att skilja livskraften i PCR-analys kan orsaka falskt positiva värden, vilket leder till överskattning av levande cell nummer i upptäckt. Följaktligen begränsar detta PCR-användning i exakt upptäckt av livsmedelsburna patogener 12. En ny metod för att skilja DNA av döda celler har tagits genom att kombinera propidium monoazide (PMA) behandling med PCR-metoden under de senaste åren 13-15. PMA kan gå inuti döda celler, och interkalera i DNA när den utsätts för ljus, men det kan inte gå in i levande celler att reagera med DNA i levande celler. Således, i PMA-behandlade blandningar av levande och döda celler, DNA från döda celler kan inte amplifieras i PCR-13. Vi kombinerade PMA behandling med den nyutvecklade qPCR analys som detekterar levande E. coli O157: H7 celler. Dessutom har vi gjort PMA-qPCR assay möjligt för hög genomströmning detektering.
Ett primärt syfte med studien innebär användning av en ORF Z3276, en unik för E. coli O157: H7, som en enda biomarkör för qPCR analys. För närvarande är de flesta qPCR analyser targeting virulensgener, såsom stx1, stx2 och EAEA 1,2,5,6 eller delade fenotypiska gener, såsom uidA 3,4, rfbE och FLIC gener 8,9. Ibland kan en art eller stam kan inte definitivt identifieras av virulens gen (er), såsom stx 1och stx två gener, såsom de gener som är närvarande i olika arter eller stammar som 16 också. Använda rfbE och FLIC för målgener är båda gener som behövs för att kunna användas för fullständig identifikation 17. Använda ORF Z3276 som biomarkör har detta qPCR analys visats vara känslig och specifik analys (tabell 1). Denna analys har utsatts för långtgående integrering, samt exklusivitet tester, inklusive O157: H7-stammar (n = 367), över 100 icke-O157-stammar och andra patogena arter, såsom Salmonella och Shigella. Alla O157: H7-stammar som undersöktes var positivt upptäcktes, och ingen korsreaktivitet hittades från de icke-O157-stammar (tabell 1), vilket tyder på att ORF Z3276 är en unik och stark biomarkör för detektion av E. coli O157: H7.
Det andra syftet med studien är att selektivt upptäcka levande celler från döda celler av PMA-behandling innan DNA-extraktion. PMA kan penetrera in i döda celler med nedsatt membran och binder till DNA och hämmar på DNA-amplifiering av döda celler i PCR 13. Vi har modifierat PMA-behandling förfarande, och anpassas till en 96-brunnsplattformat för förfarandet. Rätt ljusintensitet exponeringen är avgörande för att uppnå den optimala tvärbindningseffekt. Tidigare har mikrorör använts i detta steg 13 till 15. Emellertid separata mikrorör är svåra att hantera i ljuset exexponering för steg, och dessa rör är inte helt transparent för att erhålla den bästa tvär böjelse. Med hjälp av en 96-brunnsplatta förbättrade vi effektiviteten för PMA-behandling. Dessa förändringar kan påverka analysen på flera sätt: de gör det lättare att erhålla en noggrann och enhetlig tvärbindande verkan, speciellt med ett stort antal prover, de behandlade proverna kan flyttas från en platta till en annan för att göra det möjligt för detektion av ett stort antal av prover, och de ger denna PMA-qPCR analys med automatiseringspotential för hela processen. Begränsningen av denna PMA-qPCR-analysen är att PMA behandling ökar PCR-analys kostnaden något och något minskad känslighet PCR-analys.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar US Department of Homeland Security för att ge en del av finansieringen.
AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
2 x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
Primer Express | ABI | ||
Probes | ABI | Top of Form | |
4316033 Bottom of Form | |||
PMA | Biodium | 40013 | |
Puregen cell and tissue kit | Qiagene | Top of Form | |
158622 | |||
Bottom of Form | |||
DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
650 w halogen light source | Britek | H8061S | |
Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |