Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform
Summary
Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.
Abstract
Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Deze technologie heeft laten zien potentieel in het aanpakken van eerder uitdagende toepassingen, met inbegrip van, levering aan primaire immune cellen, cellen herprogrammeren, koolstof nanobuis, en quantum dot levering. Deze vector vrij microfluidic platform gebaseerd op mechanische verbreking van de celmembraan cytosolische levering van het doelmateriaal te vergemakkelijken. Hierin beschrijven we de gedetailleerde methode voor het gebruik van deze microfluïdische apparaten, waaronder, inrichtingsamenstel, cel voorbereiding en werking van het systeem. Deze aflevering aanpak vereist een korte optimalisatie van het type apparaat en voorwaarden voor u onaangekondigd toepassingen. De verstrekte instructies zijn generaliseerbaar naar de meeste celtypes en levering materialen als dit systeem niet gespecialiseerde buffers of chemische modificatie / vervoeging stappen vereisen. Deze werkzaamheden bieden ooks aanbevelingen over hoe de prestaties van het apparaat te verbeteren en trouble-shoot mogelijke problemen in verband met verstopping, lage levering efficiëntie en levensvatbaarheid van de cellen.
Introduction
Levering van macromoleculen aan het cytoplasma is een cruciale stap in therapeutische en wetenschappelijke toepassingen. Nanodeeltjes gemedieerde aflevering, bijvoorbeeld, is potentieel getoond gentherapie 1,2, terwijl eiwitlevering is een veelbelovende manier beïnvloeden celfunctie in zowel klinische en laboratorium 3 4 instellingen. Andere materialen, zoals kleine moleculen, quantum dots, of goud nanodeeltjes, van belang zijn in toepassingen variërend van kankertherapieën 5,6 intracellulaire etikettering 7,8 en single molecule volgen 9.
Het celmembraan is grotendeels ondoorlaatbaar voor macromoleculen. Veel bestaande technieken gebruiken polymere nanodeeltjes 10,11, liposomen 12 of chemische modificaties 13 tot membraan verstoring of endocytotische levering te vergemakkelijken. In deze werkwijzen, de levering efficiëntie en cel levensvatbaarheid vaak afhankelijk zijn van de structuur van ee doel molecuul en het celtype. Deze methoden kunnen in werking treden bij de levering van structureel uniform materiaal, zoals nucleïnezuren, maar zijn vaak niet geschikt voor de levering van structureel diverse materialen, zoals eiwitten en 14,15 nanomaterialen 7. Bovendien is de endosoomdisruptie mechanisme dat de meeste van deze werkwijzen afhankelijk is vaak inefficiënt, dus waardoor veel materiaal opgesloten in vesikel structuren 16. Tot slot, methoden die vaak ontwikkeld voor gebruik met gevestigde cellijnen niet goed vertalen naar primaire cellen.
Membraan perforeren methoden, zoals elektroporatie 17,18 en sonoporatie 19, zijn een aantrekkelijk alternatief in sommige toepassingen, maar zijn ze bekend om lage levensvatbaarheid van de cellen veroorzaken en kan worden beperkt door de lading van de doelgroep levering materiaal.
Rapid mechanische vervorming van de cellen, een microfluïdische benadering van de levering, heeft onlangs demonstrated zijn voordelen ten opzichte stroom in de context van de cel herprogrammering 20 en nanomateriaal levering 21. Deze methode berust op mechanische verbreking o de celmembraan cytosolische levering van materialen aanwezig in de omringende buffer vergemakkelijken. Het systeem heeft aangetoond waardoor potentieel in eerder uitdagende celtypen (bijv. primaire immune cellen en stamcellen) en materialen (bijvoorbeeld antilichamen en koolstof nanotubes). Hierin wordt de algemene procedure voor deze apparaten voor intracellulaire afgifte van target macromoleculen beschreven. De procedure is generaliseerbaar voor de meeste celtypes en levering materialen, maar het wordt aanbevolen dat men voeren een kort optimalisatie van de voorwaarden, zoals omschreven in onze eerder gemelde ontwerprichtlijnen 20, voor alle eerder aangegeven toepassingen. Tot op heden is het systeem met succes gebruikt voor de levering van RNA, DNA, goud nanodeeltjes, quantum dots, koolstof nanobuisjes, eiwits en dextran polymeren 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bepaalde aspecten van de beschreven experimentele procedure (dan chip ontwerp en werkingssnelheid factoren) moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype en levering materiaal het systeem wordt toegepast. De discussie die adressen volgt een aantal van de meest voorkomende factoren te overwegen bij het ontwerpen van experimenten.
Om de levering signaal voor fluorescent gelabelde verbindingen te verbeteren, moet men bronnen van achtergrond fluorescentie te pakken. Oppervlak…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken T. Shatova voor nuttige discussie over experimenteel ontwerp en data analyse. De hulp en expertise van G. Paradis, worden de personeelsleden van de flowcytometrie kern bij de Koch Instituut, en het personeel van de Microsystems Technology Laboratory van het Massachusetts Institute of Technology dankbaar erkend. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, en gedeeltelijk door de National Cancer Institute Cancer Center Support (Core) Subsidies P30-CA14051 en MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
Riferimenti
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
