לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה
Summary
עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. פרוטוקול זה מספק שלבים מפורטים כיצד להשתמש במערכת עבור מגוון רחב של יישומים.
Abstract
עיוות מכאנית מהירה של תאים התפתחה שיטה למסירה תאית של מקרומולקולות וננו מבטיחה, ללא וקטור. טכנולוגיה זו הראתה פוטנציאל בטיפול ביישומים מאתגרים בעבר, כולל, משלוח לתאים ראשוניים חיסוניים, תכנות מחדש של תאים, פחמן Nanotube, ומשלוח נקודה קוונטית. פלטפורמת microfluidic ללא וקטור זה מסתמכת על הפרעה מכאנית של קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומר היעד. במסמך זה, אנו מתארים את השיטה מפורטת של שימוש למכשירי microfluidic אלה כוללים, הרכבה מכשיר, הכנת תא, ותפעול מערכת. משלוח גישה זו מחייבת אופטימיזציה קצר של סוג המכשיר ותנאי הפעלה ליישומים לא פורסם בעבר. ההוראות שסופקו הן להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי אספקה כמערכת זו אינה דורשת מאגרים מיוחדים או צעדי שינוי כימי / הצמידה. עבודה זו מספקת גםשל המלצות על איך לשפר את ביצועי מכשיר וצרות-לירות בעיות פוטנציאליות הקשורות לסתימה, יעילות משלוח נמוכה, וכדאיויות תא.
Introduction
משלוח של מקרומולקולות להציטופלסמה התא הוא שלב קריטי ביישומים טיפוליים ומחקר. משלוח nanoparticle בתיווך, למשל, הראה פוטנציאל בטיפול גנטי 1,2, תוך מסירת החלבון היא אמצעי מבטיח של משפיע על תפקוד תאי בשני 3 ומעבדה קליניות 4 הגדרות. חומרים אחרים, כגון תרופות מולקולה קטנות, נקודות קוונטיות, או חלקיקי זהב, הם בעלי עניין ביישומים החל תרופות לסרטן 5,6 לתיוג תאיים 7,8, ומולקולה בודדת מעקב 9.
קרום התא הוא במידה רבה בלתי חדיר למקרומולקולות. קיימות טכניקות רבות משתמשות בחלקיקים פולימריים 10,11, ליפוזומים 12, או שינויים כימיים 13 כדי להקל על שיבוש קרום או מסירת endocytotic. בשיטות אלה, את כדאיות יעילות משלוח והתא הן בדרך כלל תלויה במבנה של המולקולת דואר יעד וסוג התא. שיטות אלו יכולות להיות יעילים באספקה של חומרים אחידים מבחינה מבנית, כגון חומצות גרעין, אך לעתים קרובות אינו מתאימות עבור המשלוח של יותר מבחינה מבנית מגוונת חומרים, כגון חלבונים 14,15 וננו 7. יתר על כן, מנגנון שיבוש endosome שרוב השיטות אלה מסתמכים על הוא לעתים קרובות לא יעיל, ולכן משאיר את חומר רב לכוד במבני שלפוחית 16. לבסוף, שיטות שלעתים קרובות פותחו לשימוש עם שורות תאים הוקמו לא לתרגם גם לתאים ראשוניים.
שיטות poration ממברנה, כגון electroporation 17,18 וsonoporation 19, הם חלופה אטרקטיבית ביישומים מסוימים, אך הם ידועים כגורמים לכדאיויות תא נמוכות ויכולים להיות מוגבל על ידי המטען של החומר המסירה היעד.
עיוות מכאנית מהירה של תאים, גישת microfluidic למשלוח, יש לאחרונה demonstrated היתרונות שלה על פני שיטות הנוכחיות בהקשר של תא תכנות מחדש 20 ומשלוח nanomaterial 21. שיטה זו מסתמכת על הפרעה מכאנית o קרום התא כדי להקל על הגשת cytosolic של חומרים הנמצאים בחיץ שמסביב. המערכת הוכיחה מאפשרת פוטנציאלי במאתגר בעבר סוגי תאים (למשל תאים חיסוניים ראשוניים ותאי גזע) וחומרים (למשל נוגדנים וצינורות פחמן). בזאת, ההליך הכללי להשתמש במכשירים אלה למסירה תאית של מקרומולקולות היעד מתואר. ההליך הוא להכליל את רוב סוגי תאים וחומרי משלוח, עם זאת, מומלץ שאחד לערוך אופטימיזציה קצרה של תנאים, כמפורט בהנחיות תכנון 20 שדווחו בעבר שלנו, עבור כל יישומים שלא דווחו בעבר. נכון להיום, המערכת כבר שימשה בהצלחה עבור המשלוח של RNA, DNA, חלקיקי זהב, נקודות קוונטיות, צינורות פחמן, חלבוןים, ופולימרים dextran 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
היבטים מסוימים של ההליך המתואר ניסוי (כלומר גורמים אחרים מאשר תכנון שבבים ומהירות הפעלה) ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בהתאם לסוג התא וחומר מסירת המערכת מוחל. הדיון שלהלן כתובות חלק מהגורמים הנפוצים ביותר שיש לשקול בעת תכנון ניסויים.
<p class="jove_content" style=";text-align:right;…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לט Shatova לדיון מועיל על עיצוב ניסיוני וניתוח נתונים. הסיוע והמומחיות של ג Paradis, כוח האדם של cytometry זרימת הליבה במכון קוך, ואת צוות של המעבדה לטכנולוגית מיקרוסיסטמס במכון טכנולוגית של מסצ'וסטס הכירו בהכרת תודה. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, וחלקית על ידי מכון הלאומי לסרטן סרטן מרכז תמיכה (Core) מענקי P30-CA14051 וMPP-09Call-לנגר-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
Riferimenti
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
