堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る
Summary
細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。このプロトコルは、幅広いアプリケーションのためのシステムを使用する方法の詳細な手順を提供しています。
Abstract
細胞の急速な機械的な変形は高分子およびナノ物質の細胞内送達のための有望な、ベクトルフリー法として浮上している。この技術は、以前は困難な用途に対処する電位を示した;を含む一次免疫細胞、細胞の再プログラミング、カーボンナノチューブ、量子ドット送達への送達。このベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームは、ターゲット材料のサイトゾル送達を容易にするために、細胞膜の機械的破壊に依存している。ここで、我々は、デバイス組み立て、細胞調製物、およびシステム動作を含むこれらのマイクロ流体デバイスのための使用の詳細な方法を記載している。このアプローチは、送達装置タイプ、以前に報告されていないアプリケーションの動作条件の簡単な最適化を必要とする。このシステムは、特殊な緩衝剤または化学修飾/コンジュゲーション工程を必要としないように提供される命令は、ほとんどの細胞型および送達物質に一般化される。この作品も提供Sデバイスの性能を向上させ、目詰まり、低配信効率、および細胞の生存率に関連する潜在的な問題をトラブルシュートする方法に関する推奨事項。
Introduction
細胞の細胞質への巨大分子の送達は、治療および研究用途における重要なステップである。タンパク質送達は、臨床検査室3と4の両方の設定で細胞機能に影響を与える有望な手段であるが、ナノ粒子媒介送達は、例えば、遺伝子治療の1,2のポテンシャルを示している。そのような小分子薬物、量子ドット、金ナノ粒子などの他の材料は、5,6癌治療からの細胞内標識7,8、および9を追跡単一分子までの範囲の用途において重要である。
細胞膜は、巨大分子の大部分は不透過性である。多くの既存の技術が膜破壊やエンドサイトーシスの配信を容易にするために、ポリマーナノ粒子10,11、リポソーム12、または化学修飾13を使用しています。これらの方法では、送達効率および細胞生存率は、多くの場合、目の構造に依存する電子標的分子および細胞型。これらの方法は、核酸のような構造的に均一な材料の配達時に効率的になりますが、多くの場合、そのようなタンパク質14,15ナノ材料7など、より構造的に多様な材料の配信のために病気に適している。さらに、これらの方法のほとんどはに依存しているエンドソーム破壊メカニズムは、したがって、小胞構造16に捕捉された多くの素材を残し、多くの場合、非効率的である。最後に、多くの場合、確立された細胞株を使用するために開発されている方法は、一次細胞にうまく変換されません。
例えば、エレクトロポレーション17,18および19ソノポレーションのような膜ポレーション法は、いくつかの用途において魅力的な代替物であるが、それらは、低い細胞生存率を引き起こすことが知られており、標的デリバリー材料の電荷によって制限され得る。
細胞の急速な機械的変形、納品までのマイクロ流体アプローチは、最近になっていますdemonstr細胞の再プログラミング20とナノマテリアルの配信21のコンテキストで現在の技術に比べてその利点をated。この方法は、周囲の緩衝液中に存在する物質のサイトゾル送達を促進する細胞膜oを機械的な破壊に依存している。システムが以前に挑戦的細胞型において潜在的に可能にする（ 例えば、一次免疫細胞および幹細胞）を実証し、物質（ 例えば 、抗体およびカーボンナノチューブ）している。ここで、標的巨大分子の細胞内送達のためにこれらのデバイスを使用するための一般的な手順を説明する。しかし、それは以前に報告されていないアプリケーションのために、私たちの以前に報告された設計指針20で詳述するように1が、条件の簡単な最適化を実施することをお勧めします。手順は、ほとんどの細胞型および送達物質に一般化される。今日までに、システムは、RNA、DNA、金ナノ粒子、量子ドット、カーボンナノチューブ、タンパク質の送達のために首尾よく使用されているS、およびデキストランポリマー20,21。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載の実験方法（チップ設計及び動作速度以外、すなわち因子）の特定の局面では、システムが適用される細胞タイプおよび送達材料に応じて最適化される必要があり得る。アドレスに実験を設計する際に考慮すべき最も一般的な要因のいくつかを以下の考察。
蛍光標識された化合物のための送出信号を改善するためには、バックグラウンド蛍光の供給源に対処?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、実験デザインとデータ分析の有用な議論のために、T. Shatovaに感謝します。 G·パラディの支援と専門知識は、マサチューセッツ工科大学のコッホ研究所のコアフローサイトメトリー、およびマイクロシステム技術研究所のスタッフの人が感謝して承諾されます。この作品は、健康補助金RC1 EB011187-02、DE013023、DE016516、EB000351の国立研究所によってサポートされ、部分的に国立がん研究所がんセンターサポート（コア）で、P30-CA14051およびMPP-09Call-ランガー-60を付与した。
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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