Espremendo celular como uma plataforma de entrega intracelular Robust Microfluidic
Summary
Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Este protocolo fornece etapas detalhadas sobre como usar o sistema para uma ampla gama de aplicações.
Abstract
Deformação mecânica rápida de células surgiu como um método promissor, livre do vector para a entrega intracelular de macromoléculas e nanomateriais. Esta tecnologia tem mostrado potencial para enfrentar aplicações previamente desafiantes, incluindo, a entrega de pilhas imunes, reprogramação celular, nanotubos de carbono, e entrega ponto quântico. Esta plataforma de microfluidos livre do vector depende de ruptura mecânica da membrana celular para facilitar a entrega citosólica do material alvo. Relata-se o método detalhado de uso para esses dispositivos microfluídicos, incluindo, a montagem do dispositivo, a preparação celular, e operação do sistema. Esta abordagem requer a entrega de uma breve otimização do tipo de dispositivo e as condições de operação para aplicações previamente não-relatados. As instruções fornecidas são generalizáveis para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, este sistema não requer buffers especializados ou etapas modificação química / conjugação. Este trabalho também fornecers recomendações sobre como melhorar o desempenho do dispositivo e de problemas disparar potenciais problemas relacionados com a obstrução, a eficiência de entrega baixos, ea viabilidade celular.
Introduction
A entrega de macromoléculas para o citoplasma da célula é um passo crítico para aplicações terapêuticas e de pesquisa. Nanopartículas de entrega mediada, por exemplo, revelou potencial na terapia de genes de 1,2, enquanto que a entrega de proteína é uma forma promissora de afectar a função celular, tanto clínicas e laboratoriais 3 4 configurações. Outros materiais, tais como medicamentos de pequenas moléculas, pontos quânticos, ou nanopartículas de ouro, são de interesse em aplicações que vão desde o tratamento do câncer de 5,6 para 7,8 rotulagem intracelular, e única molécula de rastreamento 9.
A membrana da célula é largamente impermeável a macromoléculas. Muitas técnicas existentes usar nanopartículas poliméricas 10,11, lipossomas 12 ou 13 modificações químicas para facilitar a ruptura da membrana ou a entrega endocítica. Nestes métodos, a eficiência de entrega e a viabilidade celular são muitas vezes dependentes da estrutura do the molécula-alvo e do tipo de célula. Estes métodos podem ser eficientes na entrega de materiais estruturalmente uniformes, tais como os ácidos nucleicos, mas são muitas vezes mal adaptados para a entrega de mais estruturalmente diversos materiais, tais como proteínas e os nanomateriais 14,15 7. Além disso, o mecanismo de interrupção do endossoma que a maioria destes métodos baseiam-se é muitas vezes ineficaz, deixando, portanto, muito material aprisionado em estruturas vesiculares 16. Finalmente, os métodos que são muitas vezes desenvolvidos para utilização com as linhas de células estabelecidas, não se traduz bem a células primárias.
Métodos Membrane poração, como eletroporação 17,18 e sonoporação 19, são uma alternativa atraente em algumas aplicações, no entanto, eles são conhecidos por causar a viabilidade celular de baixo e pode ser limitada pela carga do material de entrega alvo.
Deformação mecânica rápida de células, uma abordagem microfluídicos para entrega, tem recentemente demonstrated suas vantagens em relação às técnicas actuais no contexto de reprogramação das células 20 e 21 de fornecimento de nanomateriais. Este método baseia-se o desmembramento mecânico da membrana celular para facilitar a entrega citosólica de materiais presentes no tampão circundante. O sistema demonstrou permitindo potencial anteriormente desafiando tipos de células (por exemplo, células imunes primárias e as células-tronco) e materiais (por exemplo, anticorpos e os nanotubos de carbono). Aqui, o processo geral para utilizar estes dispositivos para a entrega intracelular de macromoléculas alvo é descrita. O procedimento é generalizável para a maioria dos tipos de células e materiais de entrega, no entanto, recomenda-se que uma realização de uma breve otimização das condições, conforme detalhado em nossas diretrizes previamente relatados projeto 20, para todas as aplicações anteriormente não declaradas. Até à data, o sistema tem sido utilizado com sucesso para a entrega de RNA, DNA, as nanopartículas de ouro, quantum dots, nanotubos de carbono, proteínas, e polímeros de dextrano 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Certos aspectos do procedimento experimental descrito (isto é, com excepção de design de chips e a velocidade de funcionamento factores) pode necessitar de ser optimizada, dependendo do tipo de célula e material de entrega que o sistema é aplicado. A discussão que se segue aborda alguns dos fatores mais comuns a considerar ao projetar experimentos.
Para melhorar o sinal de entrega para compostos marcados com fluorescência, é preciso abordar as fontes de fluorescência de fun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos T. Shatova para discussão útil em delineamento experimental e análise de dados. A assistência e competências de G. Paradis, o pessoal da citometria de fluxo do núcleo do Instituto Koch, e os funcionários do Laboratório de Tecnologia Microsystems no Instituto de Tecnologia de Massachusetts estão reconhecido agradecimento. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Grants Saúde RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351, e parcialmente pelo Instituto Nacional do Câncer Cancer Center Support (Core) Concede-P30 CA14051 e MPP-09Call-Langer-60.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
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