Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma
Summary
Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.
Abstract
Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknoloji daha önce zorlu uygulamaları ele potansiyel göstermiştir; dahil, primer immün hücrelerin, hücre yeniden programlanması, karbon nanotüp ve kuantum nokta teslim teslimat. Bu vektör içermeyen mikroakışkan platformu hedef maddenin sitosolik sağlanmasının kolaylaştırılması için, hücre zarının mekanik parçalama dayanır. Burada, montaj cihazı, hücre hazırlama ve sistem çalışması dahil olmak üzere, bu mikroakışkan cihazlar için kullanımının detaylı bir yöntem tarif eder. Bu teslim yaklaşım cihaz tipi ve daha önce bildirilmemiş uygulamalar için çalışma koşulları kısa bir optimizasyon gerektirir. Bu sistem, özel tamponlar veya kimyasal modifikasyon / çekimi adımlar gerektirmez olarak verilen talimatlar çoğu hücre tipi ve dağıtım malzemeleri genellenebilir bulunmaktadır. Bu çalışma aynı zamanda sağlamaks cihazın performansını artırmak ve tıkanma, düşük bir uygulama randımanı, ve hücre canlılığı ile ilgili potansiyel sorunları sorunsuz çekmek için nasıl öneriler.
Introduction
Hücre sitoplazmaya makromoleküllerin teslim tedavi ve araştırma uygulamalarında önemli bir adımdır. Protein teslim 3 klinik ve laboratuar hem de 4 ortamlarında hücre fonksiyonunu etkileyen gelecek vaat eden bir araçtır ise Nanopartikül aracılı teslim, örneğin, gen terapi 1,2 potansiyel göstermiştir. Bu tür küçük moleküllü ilaçlar, kuantum noktaları veya altın nano partiküller gibi diğer malzemeler, 5,6 kanser tedavileri ikinci izleme 9, hücre içi etiketleme 7,8 ve tek bir molekül kadar uygulamalarda ilgi çekicidir.
Hücre zarı makromoleküllere ölçüde geçirimsizdir. Birçok mevcut olan tekniklerin büyük membran bozulması ya da endositoksik iletilmesini kolaylaştırmak için 10,11 polimerik nano parçacıklar, lipozomlar 12 ya da kimyasal değişiklikler 13 kullanır. Bu yöntemlerde, teslimat verimlilik ve hücre canlılığı th yapısına genellikle bağlıdıre hedef molekül, ve hücre türü. Bu yöntemler, böyle bir nükleik asit gibi, yapısal olarak tek tip malzemeler, doğum sırasında etkili olabilir, ancak genellikle bu tür proteinlerin ve 14,15 nanomalzemelerin 7 daha fazla yapısal olarak farklı malzemeler, teslimat için kötü uygundur. Ayrıca, bu yöntemlerin çoğu güveniyor endozom bozulma mekanizması dolayısıyla kesecik yapılarda 16 sıkışıp çok malzemeyi bırakarak, genellikle verimsiz. Son olarak, sık sık kurulan hücre hatları ile kullanım için geliştirilen yöntemler primer hücrelerde iyi tercüme etmeyin.
, Elektroporasyon 17,18 ve 19 sonoporation membran gözeneklendirme yöntemleri, bazı uygulamalarda, cazip bir alternatif olmakla birlikte, düşük hücre canlılığı neden olduğu bilinmektedir ve hedef dağıtım malzemesinin şarj ile sınırlı olabilir.
Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon, teslimat microfluidic yaklaşım, son zamanlarda vardır demonstrbir hücrenin yeniden programlanması 20 ve nano malzeme teslimat 21 bağlamında, mevcut tekniklere göre avantajları ×. Bu yöntem, çevreleyen tamponu içinde bulunan maddelerin sitosolik iletilmesini kolaylaştırmak için hücre zarı o mekanik parçalama dayanır. Sistem daha önce hücre tipleri zorlu (primer immün hücreler ve kök hücreleri) ve malzemeleri (örneğin antikorlar ve karbon nanotüpler) potansiyeli sağlayan göstermiştir. Burada, hedef makromoleküllerin hücre içi iletimi için bu cihazların kullanımı için genel prosedür tarif edilmektedir. Ancak, daha önce bildirilmemiş uygulamalar için, bizim daha önce bildirilen tasarım kuralları 20 ayrıntılı olarak bir, koşulların kısa bir optimizasyon yapması tavsiye edilir; prosedür çoğu hücre tipleri ve dağıtım malzemeleri genellenebilir. Bugüne kadar, sistem RNA, DNA, altın nano-tanecikleri, kuantum noktaları, karbon nanotüp, protein verilmesi için başarılı bir şekilde kullanılmıştırs ve dekstran polimerleri 20,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anlatılan deney yöntemi (yonga tasarımı ve çalışma hızı dışında örneğin faktörler) bazı özellikleri sistem uygulanır hücre tipi ve dağıtım materyale bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilir. Adreslerinin deneylerini tasarlarken dikkate en yaygın bazı faktörlerin aşağıdaki tartışma.
Floresan etiketli bileşikler için teslim sinyal geliştirmek için, bir eşiğe kaynaklarını ele gerekiyor. Yüzey bağlayıcı ve endositoz, örneğin, kültür ya d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz deney tasarımı ve veri analizi yararlı tartışma T. Shatova teşekkür ederim. G. Paradis yardım ve uzmanlık, Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nde Koch Enstitüsü çekirdek akım sitometri ve Microsystems Teknoloji Laboratuvarı personelinin personel müteĢekkiriz. Bu çalışma Sağlık Hibeler RC1 EB011187-02, DE013023, DE016516, EB000351 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve kısmen Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek (Çekirdek) tarafından P30-CA14051 ve MPP-09Call-Langer-60 Grants edildi.
Materials
| Device Holder & Plastic reservoir | SQZ Biotechnologies | Holder | |
| LSRFortessa Analyzer | Becton Dickinson | N/A | Flow cytometry machine used at the Koch Institute Core Facilities |
| Microfluidic device | SQZ Biotechnologies | Cell Squeeze | |
| O-Rings | McMaster | 9452K311 | |
| Pressure system to operate device | SQZ Biotechnologies | Pressure System | |
| Tweezers | |||
| Ultrasound bath |
Riferimenti
- Schaffert, D., Wagner, E. Gene therapy progress and prospects: synthetic polymer-based systems. Gene. Ther. 15, 1131-1138 (2008).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 8, 129-138 (2009).
- Leader, B., Baca, Q. J., Golan, D. E. Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 21-39 (2008).
- Kim, D., et al. Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Dhar, S., Daniel, W. L., Giljohann, D. A., Mirkin, C. A., Lippard, S. J. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) Warheads. J. Am. Chem. Soc. 131, 14652-14653 (2009).
- Jiang, Z. -. X., Zhang, Z. -. Y. Targeting PTPs with small molecule inhibitors in cancer treatment. Cancer and Metastasis Reviews. 27, 263-272 (2008).
- Derfus, A. M., Chan, W. C. W., Bhatia, S. N. Intracellular Delivery of Quantum Dots for Live Cell Labeling and Organelle Tracking. Adv. Mater. 16, 961-966 (2004).
- Michalet, X., et al. Quantum Dots for Live Cells in Vivo Imaging, and Diagnostics. Science. 307, 538-544 (2005).
- Dahan, M., et al. Diffusion Dynamics of Glycine Receptors Revealed by Single-Quantum Dot Tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
- Slowing, I. I., Trewyn, B. G., Lin, V. S. Y. Mesoporous Silica Nanoparticles for Intracellular Delivery of Membrane-Impermeable Proteins. J. Am. Chem. Soc. 129, 8845-8849 (2007).
- Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 581-593 (2005).
- Joseph, Z. Cationic lipids used in gene transfer. Advanced Drug Delivery Reviews. 27 (97), 17-28 (1997).
- Verma, A., et al. Surface-structure-regulated cell-membrane penetration by monolayer-protected nanoparticles. Nat. Mater. 7, 588-595 (2008).
- Yan, M., et al. A novel intracellular protein delivery platform based on single-protein nanocapsules. Nat. Nano. 5, 48-53 (2010).
- Shi Kam, N. W., Jessop, T. C., Wender, P. A., Dai, H. Nanotube Molecular Transporters: Internalization of Carbon Nanotube-Protein Conjugates into Mammalian Cells. J. Am. Chem. Soc. 126, 6850-6851 (2004).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- li, S. Electroporation Gene Therapy: New Developments In Vivo and In Vitro. Current Gene Therapy. 4, 309-316 (2004).
- Fox, M., et al. Electroporation of cells in microfluidic devices: a review. Anal. Bioanal. Chem. 385, 474-485 (2006).
- Miller, D. L., Pislaru, S. V., Greenleaf, J. F. Sonoporation: Mechanical DNA Delivery by Ultrasonic Cavitation. Somatic Cell and Molecular Genetics. 27, 115-134 (2002).
- Sharei, A., et al. A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 2082-2087 (2013).
- Lee, J., et al. Nonendocytic Delivery of Functional Engineered Nanoparticles into the Cytoplasm of Live Cells Using a Novel, High-Throughput Microfluidic Device. Nano Lett. 12, 6322-6327 (2012).
