Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
Etichettatura cellule gangliari della retina come retrograde (RGCs) in grado di isolare RGC somata di morire siti, è diventato il gold standard per il conteggio RGC nella sopravvivenza RGCs ed esperimenti di rigenerazione. Molti studi sono stati condotti negli animali mammiferi per ricercare la sopravvivenza RGC dopo la lesione del nervo ottico. Tuttavia, marcatura retrograda di RGCs in zebrafish adulto non è ancora stato segnalato, anche se alcuni metodi alternativi possono contare il numero di cellule negli strati della retina cellule gangliari (RGCL). Considerando le piccole dimensioni del cranio adulto zebrafish e l'alto rischio di morte dopo la foratura sul cranio, apriamo il cranio con l'aiuto di acido-incisione e sigillare il foro con un legame fotopolimerizzazione, che potrebbero migliorare significativamente il tasso di sopravvivenza. Dopo aver assorbito le tinture per 5 giorni, quasi tutti i RGC sono etichettati. Dato che questo metodo non ha bisogno di transetto il nervo ottico, è insostituibile nella ricerca della sopravvivenza RGC dopo schiacciamento del nervo ottico in zebrafish adulto. Qui, vi presentiamoquesto metodo passo passo e fornire risultati rappresentativi.
Introduction
Come zebrafish adulto ha una forte capacità di rigenerare gli assoni dopo la lesione del nervo ottico 1, un metodo corretto per contare tutto il RGC è essenziale per valutare la sopravvivenza RGCs e rigenerazione 2. Sulla base dei metodi di RGCs marcatura retrograda in mammiferi e pesci rossi 3-5, abbiamo costruito il metodo per etichettare RGCs dal Tectum in zebrafish adulto. Per zebrafish adulto, due problemi tecnici critici devono essere notato: il cranio di zebrafish adulto è molto piccolo 6; vivono in un ambiente acquatico. Qui, trattiamo il cranio con mordenzante che riduce al minimo i rischi associati alla perforazione 5. Poi, abbiamo sigillare il foro con vincolo di polimerizzazione luce che migliora la sopravvivenza degli animali dopo l'intervento chirurgico.
In precedenza, sono state adottate diverse altre tecniche per contare il numero RGCs in modi indiretti. HE colorazione in sezioni retina etichetta tutti i tipi di cellule nel RGCL 7. Etichettatura anticorpo in tutta rEtina, come isolotto-1, può anche marcare cellule amacrine 8. Anche se l'etichetta retrogrado dal moncone del nervo ottico può etichettare tutti RGCs nella retina, non può essere adottato nel modello calca perché provoca lesioni più al nervo ottico. Approfittando di etichetta retrogrado dal Tectum, abbiamo ricercato la sopravvivenza RGC e il rinnovamento nelle schiacciamento del nervo ottico. I risultati mostrano che quasi tutti RGCs sopravvissero e oltre il 90% di RGCs rigenerati al Tectum alla prima settimana nel modello calca 9.
Al fine di etichettare correttamente tutti RGC, pasta DII è stato scelto dopo un confronto con diversi altri coloranti commerciali 10. In primo luogo, è stato appositamente progettato per l'etichettatura tessuto in vivo. In secondo luogo, è un colorante lipofilo che non può diffondere in acqua. Inoltre, questa fluorescenza può persistere per lungo tempo che gli rende un candidato ideale per RGC ricerca sopravvivenza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Marcatura retrograda di RGC è importante per ricercare sopravvivenza RGC in mammiferi, ma non è stato usato in zebrafish. I metodi alternativi, HE macchiava 7 e colorazione anticorpale 8, non sono gold standard per il conteggio numero RGC, e le linee transgeniche con tutti RGCs etichettati non ha ancora stati costruiti 12, 13. In questo video, vi presentiamo un metodo per retrograda RGCs etichette nella retina di zebrafish adulto. Anche se circa l'1% degli assoni proiettano al bulb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
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