وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
وضع العلامات خلايا الشبكية العقدة كما الوراء (RGCs) يمكن عزل RGCs somata من الموت المواقع، فقد أصبح معيار الذهب لحساب RGCs في بقاء RGCs والتجارب التجدد. وقد أجريت العديد من الدراسات في الحيوانات الثديية للبحث بقاء RGCs بعد إصابة العصب البصري. ومع ذلك، لم يتم حتى الآن وضع العلامات ذكرت الوراء من RGCs في الزرد الكبار، على الرغم من بعض طرق بديلة يمكن الاعتماد أعداد الخلايا في شبكية العين طبقات الخلايا العقدية (RGCL). بالنظر إلى حجم صغير من الكبار الجمجمة الزرد ومخاطر عالية للوفاة بعد الحفر على الجمجمة، ونحن فتح الجمجمة مع مساعدة من حمض النقش وختم الحفرة مع السندات علاج الخفيفة، والتي يمكن أن تحسن كبير في معدل البقاء على قيد الحياة. بعد امتصاص الأصباغ لمدة 5 أيام، وصفت تقريبا جميع RGCs. كما لا تحتاج هذه الطريقة إلى القطع العصب البصري، بل هو لا يمكن الاستغناء عنه في مجال البحث من بقاء RGCs بعد سحق البصرية العصبية في الزرد الكبار. هنا، ونحن نقدمهذه الخطوة خطوة، وطريقة تقديم نتائج ممثل.
Introduction
كما الزرد الكبار لديهم قدرة قوية لتجديد محاور عصبية بعد إصابة العصب البصري 1، وهي الطريقة الصحيحة لحساب RGCs كله أمر ضروري لتقييم بقاء RGCs والتجديد 2. استنادا إلى طرق وضع العلامات RGCs إلى الوراء في الثدييات وذهبية 3-5، اقمنا طريقة لتسمية RGCs من السقف في الزرد الكبار. لالزرد الكبار، وتجدر الإشارة إلى شاغلين التقنية الحرجة: جمجمة الزرد الكبار صغيرة جدا 6؛ أنهم يعيشون في بيئة المياه. هنا، ونحن علاج الجمجمة مع منمش مما يقلل المخاطر المرتبطة حفر 5. ثم، فإننا ختم حفرة مع السندات علاج ضوء الذي يحسن البقاء على قيد الحياة الحيوانية بعد الجراحة.
سابقا، تم اعتماد العديد من التقنيات الأخرى لحساب عدد RGCs بطرق غير مباشرة. سعادة تلطيخ في الأقسام الشبكية تسميات جميع أنواع الخلايا في RGCL 7. وضع العلامات الأجسام المضادة في ص كلهetina، مثل جزيرة-1، ويمكن أيضا تسمية الخلايا عديم الاستطالات 8. على الرغم من التسمية إلى الوراء من الجدعة العصب البصري يمكن تسمية كل RGCs في شبكية العين، فإنه لا يمكن اعتمادها في نموذج سحق لأنه يسبب الإصابة إضافية إلى العصب البصري. الاستفادة من التسمية إلى الوراء من السقف، ولقد بحثت بقاء RGCs والتجديد في سحق البصرية العصبية. تظهر النتائج أن ما يقرب من جميع RGCs نجا وأكثر من 90٪ من RGCs مجدد إلى السقف في الأسبوع الأول في النموذج سحق 9.
من أجل تسمية كل RGCs بنجاح، وقد تم اختيار معجون الجاذبة بعد المقارنة مع العديد من الأصباغ التجارية الأخرى 10. أولا، ومصمم خصيصا لوضع العلامات في الجسم الحي الأنسجة. ثانيا، بل هو صبغ محبة للدهون التي لا يمكن منتشر في الماء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذا مضان تستمر لفترة طويلة مما يجعله مرشح ممتاز للبقاء RGCs البحوث.
Protocol
Representative Results
Discussion
وضع العلامات إلى الوراء من RGCs المهم للبحث بقاء RGCs في الحيوانات الثديية، ولكن لم يتم استخدامه في الزرد. الطرق البديلة، وسعادة تلطيخ 7 و 8 تلوين الأجسام المضادة، ليست معايير الذهب لحساب عدد RGCs، وخطوط المعدلة وراثيا مع جميع RGCs وصفت لم يتم بناؤها 12، 13. في …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
Riferimenti
- Wyatt, C., et al. Analysis of the astray/robo2 zebrafish mutant reveals that degenerating tracts do not provide strong guidance cues for regenerating optic axons. J Neurosci. 30, 13838-13849 (2010).
- Grieshaber, P., Lagreze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. J Neurosci Methods. 192, 233-239 (2010).
- Schwalb, J. M., et al. Two factors secreted by the goldfish optic nerve induce retinal ganglion cells to regenerate axons in culture. J Neurosci. 15, 5514-5525 (1995).
- Watanabe, M., Inukai, N., Fukuda, Y. Survival of retinal ganglion cells after transection of the optic nerve in adult cats: a quantitative study within two weeks. Vis Neurosci. 18, 137-145 (2001).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. , (2008).
- Bakken, T. E., Stevens, C. F. Visual system scaling in teleost fish. J Comp Neurol. 520, 142-153 (2012).
- Zhou, L. X., Wang, Z. R. Changes in number and distribution of retinal ganglion cells after optic nerve crush in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 35, 159-162 (2002).
- Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
- Zou, S., Tian, C., Ge, S., Hu, B. Neurogenesis of retinal ganglion cells is not essential to visual functional recovery after optic nerve injury in adult zebrafish. PLoS One. 8, (2013).
- Choi, D., Li, D., Raisman, G. Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: a comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI. J Neurosci Methods. 117, 167-172 (2002).
- Zou, S. Q., et al. Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish. J Vis Exp. , (2010).
- Tokuoka, H., Yoshida, T., Matsuda, N., Mishina, M. Regulation by glycogen synthase kinase-3beta of the arborization field and maturation of retinotectal projection in zebrafish. J Neurosci. 22, 10324-10332 (2002).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132, 2955-2967 (2005).
- Li, L., Dowling, J. E. Disruption of the olfactoretinal centrifugal pathway may relate to the visual system defect in night blindness b mutant zebrafish. Journal of Neuroscience. 20, 1883-1892 (2000).
- Kassing, V., Engelmann, J., Kurtz, R. Monitoring of Single-Cell Responses in the Optic Tectum of Adult Zebrafish with Dextran-Coupled Calcium Dyes Delivered via Local Electroporation. PLoS One. 8, (2013).
