फ्लोरोसेंट रंगों के साथ वयस्क zebrafish में रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के प्रतिगामी लेबलिंग
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
जैसा कि प्रतिगामी लेबलिंग रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCs) साइटों मरने से RGCs somata अलग कर सकते हैं, यह RGCs अस्तित्व और उत्थान प्रयोगों में RGCs गिनती के लिए सोने के मानक बन गया है. कई अध्ययनों से ऑप्टिक तंत्रिका चोट के बाद RGCs अस्तित्व अनुसंधान करने के लिए स्तनधारी पशुओं में प्रदर्शन किया गया है. कुछ वैकल्पिक तरीकों रेटिना नाड़ीग्रन्थि सेल परतों (RGCL) में सेल नंबर भरोसा कर सकते हैं, हालांकि हालांकि, वयस्क zebrafish में RGCs के प्रतिगामी लेबलिंग अभी तक रिपोर्ट नहीं दी है. वयस्क zebrafish खोपड़ी के छोटे आकार और खोपड़ी पर ड्रिलिंग के बाद मौत के उच्च जोखिम को देखते हुए, हम एसिड नक़्क़ाशी की मदद से खोपड़ी खुला और काफी जीवित रहने की दर में सुधार सकता है जो एक प्रकाश इलाज बंधन, साथ छेद सील. 5 दिनों के लिए रंगों को अवशोषित करने के बाद, लगभग सभी RGCs लेबल रहे हैं. इस विधि ऑप्टिक तंत्रिका आड़ा काट की जरूरत नहीं है के रूप में, यह वयस्क zebrafish में ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने के बाद RGCs अस्तित्व के अनुसंधान में अपूरणीय है. यहाँ, हम परिचयइस विधि कदम से कदम और प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं.
Introduction
वयस्क zebrafish गिनती करने के लिए ऑप्टिक तंत्रिका चोट के बाद 1 axons पुनर्जीवित करने के लिए एक मजबूत करने की क्षमता, एक उचित तरीका है के रूप में पूरी RGCs RGCs अस्तित्व और उत्थान 2 का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है. स्तनधारी और सुनहरी 3 में प्रतिगामी लेबलिंग RGCs के तरीकों के आधार पर – 5, हम वयस्क zebrafish में tectum से RGCs लेबल करने के लिए विधि निर्माण किया. वयस्क zebrafish के लिए, दो महत्वपूर्ण तकनीकी चिंताओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए: वयस्क zebrafish की खोपड़ी 6 बहुत छोटा है; वे एक पानी के वातावरण में रहते हैं. यहाँ, हम 5 ड्रिलिंग से जुड़े खतरों को कम करता है जो एचेंट साथ खोपड़ी का इलाज. फिर, हम सर्जरी के बाद पशु अस्तित्व में सुधार जो प्रकाश इलाज बांड के साथ छेद सील.
इससे पहले, कई अन्य तकनीकों अप्रत्यक्ष तरीके में RGCs संख्या गिनने के लिए अपनाया गया. महामहिम रेटिना वर्गों में धुंधला RGCL 7 में कोशिकाओं के सभी प्रकार के लेबल. पूरे r में एंटीबॉडी लेबलिंगऐसे आइलेट -1 के रूप में etina, भी amacrine कोशिकाओं 8 लेबल कर सकते हैं. ऑप्टिक तंत्रिका स्टंप से पतित लेबल रेटिना में सभी RGCs लेबल कर सकते हैं हालांकि यह ऑप्टिक तंत्रिका अतिरिक्त चोट के कारण है, क्योंकि यह क्रश मॉडल में अपनाया नहीं जा सकता. Tectum से पतित लेबल का लाभ उठाते हुए, हम ऑप्टिक तंत्रिका को कुचलने में RGCs अस्तित्व और उत्थान शोध किया है. परिणाम लगभग सभी RGCs बच गया और RGCs के 90% से अधिक कुचलने मॉडल 9 में पहले सप्ताह में tectum को पुनर्जीवित करता है.
सफलतापूर्वक सभी RGCs लेबल करने के लिए, DiI पेस्ट कई अन्य वाणिज्यिक रंजक 10 के साथ तुलना के बाद चुना गया था. सबसे पहले, यह विशेष रूप से vivo में ऊतक लेबलिंग के लिए बनाया गया है. दूसरे, यह पानी में फैलाना नहीं कर सकते हैं जो एक lipophilic डाई है. साथ ही, यह प्रतिदीप्ति यह RGCs अस्तित्व अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट उम्मीदवार बनाती है, जो एक लंबे समय के लिए बच सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
RGCs के प्रतिगामी लेबलिंग स्तनधारी पशुओं में RGCs अस्तित्व अनुसंधान करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह zebrafish में इस्तेमाल नहीं किया गया. वैकल्पिक तरीकों, वह 7 धुंधला और एंटीबॉडी धुंधला 8, RGCs संख्या की ग…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
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