蛍光色素で大人のゼブラフィッシュの網膜神経節細胞の逆行性標識
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
逆行性標識網膜神経節細胞（RGC）がサイトを死んでからのRGC細胞体を分離することができるように、それはのRGCの生存と再生の実験でのRGCをカウントするためのゴールドスタンダードとなっている。多くの研究は、視神経損傷後のRGC生存を検索するには哺乳類動物において行われている。いくつかの代替の方法は、網膜神経節細胞層（RGCL）で細胞数をカウントすることができますがしかし、成人のゼブラフィッシュにおけるRGCの逆行性標識はまだ報告されていない。成体ゼブラフィッシュ頭蓋骨のサイズが小さく、頭蓋骨にドリル後の死亡の高いリスクを考慮すると、我々は、酸エッチングを利用して頭蓋骨を開いて、有意に生存率を改善することができる光硬化性ボンドで穴を密封する。 5日間の染料を吸収した後、ほぼすべてのRGCをラベル付けされている。このメソッドは、視神経を横断する必要がないとして、それは大人のゼブラフィッシュにおける視神経挫滅した後のRGC生存の研究にかけがえのないです。ここではご紹介この方法ステップバイステップとは、代表的な結果を提供します。
Introduction
大人のゼブラフィッシュは、視神経損傷1の後に軸索を再生する強力な能力を持っているように、全体のRGCをカウントするための適切な方法は、RGCを生存と再生2を評価することが不可欠である。哺乳類や金魚3の逆行性標識のRGCの方法に基づいて– 5、私たちは、大人のゼブラフィッシュにおける視蓋からのRGCを標識する方法を構築した。大人のゼブラフィッシュの場合は、2の重要な技術的な問題に注意する必要があります。大人のゼブラフィッシュの頭蓋骨は、6非常に小さい。彼らは水環境に住んでいます。ここでは、5掘削に伴う危険を最小限に抑えることがエッチング液で頭蓋骨を扱う。その後、我々は手術後、動物の生存率を改善する光硬化性ボンドで穴を密閉する。
以前は、いくつかの他の技術は、間接的な方法でのRGCの数をカウントするために採用された。網膜切片における染色HEはRGCL 7内のセルのすべてのタイプのラベルを付けます。全体Rでの抗体標識このような膵島-1のようなetinaも、アマクリン細胞8にラベルを付けることができます。視神経の切り株から逆行標識は、網膜内のすべてのRGCにラベルを付けることができますが、それは視神経への追加として傷害の原因になりますので、それはクラッシュモデルで採用することができない。蓋から逆行ラベルを利用して、我々は視神経挫滅でのRGCの生存と再生を研究している。結果は、ほとんどすべてのRGCが生存し、RGCの90％以上がクラッシュモデル9の最初の週で蓋を再生成することを示している。
正常にすべてのRGCを標識するために、DiIをペーストは、他のいくつかの市販の染料10との比較後に選択されました。第一に、これは特にin vivoでの組織標識のために設計されている。第二に、それは、水に拡散することができない、親油性染料である。さらに、この蛍光はそれのRGC生存研究のための優れた候補になり、長時間持続することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
RGCの逆行性標識は、哺乳類動物でのRGCの生存を研究することは重要であるが、それはゼブラフィッシュで使用されていなかった。代替の方法は、彼が7と抗体染色8染色 、ラベルされたすべてのRGCでのRGC番号、およびトランスジェニック系統をカウントするための金規定するものではありません、まだ12、13を構築されていません。このビデオでは、大人のゼブラフィ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
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