형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링
Summary
We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.
Abstract
로 역행 라벨 망막 신경절 세포 (망막 신경절)이 사이트를 죽음에서 망막 신경절의 인 somata를 분리 할 수 있습니다, 그것은 망막 신경절의 생존과 재생 실험에서 망막 신경절을 계산위한 황금 표준이되었습니다. 많은 연구 시신경 손상 후 망막 신경절 생존 조회 포유류 동물에서 수행되었다. 몇 가지 다른 방법은 망막 신경절 세포 레이어 (RGCL)의 세포 수를 셀 수 있지만 그러나, 성인 zebrafish에있는 망막 신경절의 역행 라벨은 아직보고되지 않았습니다. 성인 zebrafish의 두개골의 작은 크기와 두개골에 드릴링 후에 사망 고위험 감안하면 산 – 에칭에 도움으로 두개골을 열고 크게 생존율을 향상시킬 수있는 광 경화성 본드로 구멍을 밀봉. 5 일 동안 염료를 흡수 한 후, 거의 모든 망막 신경절이 표시되어 있습니다. 이 방법은 시신경을 절개 할 필요가 없다, 그것은 성인 zebrafish에있는 시신경의 호감 후 망막 신경절 생존의 연구에 바꾸어 놓을 수없는 것입니다. 여기, 우리는 소개이 방법을 단계별로하고 대표적인 결과를 제공합니다.
Introduction
성인 제브라 피쉬가 계산하는 시신경 손상 1 일 이후 축삭을 재생 할 수있는 강력한 능력, 적절한 방법이으로 전체 망막 신경절은 망막 신경절의 생존과 재생 2을 평가하는 것이 필수적입니다. 포유 동물과 금붕어 3 역행 라벨 망막 신경절의 방법에 따라 – 5, 우리는 성인 제브라 피쉬의 tectum에서 망막 신경절 레이블을하는 방법을 건설했다. 성인 제브라 피쉬의 경우, 두 가지 중요한 기술적 인 문제는 주목해야한다 : 성인 제브라 피쉬의 두개골에는 6 개의 아주 작은; 그들은 물 환경에서 살고있다. 여기, 우리는 5 시추와 관련된 위험을 최소화 에칭액 두개골을 취급합니다. 다음, 우리는 수술 후 동물의 생존을 향상 광중합 결합으로 구멍을 밀봉.
이전에는 몇 가지 다른 기술은 간접 방법으로 망막 신경절의 수를 계산하기 위해 채택되었다. HE가 망막 부분에서 염색하면 RGCL 7 세포의 모든 종류의 라벨. 전체 R 항체 라벨링이러한 섬-1과 etina는 또한 무 축삭 세포 8 레이블을 지정할 수 있습니다. 시신경의 그루터기에서 역행 레이블이 망막에있는 망막 신경절 라벨을 할 수 있지만 그것은 시신경에 추가 부상의 원인이되기 때문에, 그것은 호감 모델에 채택 할 수 없습니다. tectum에서 역행 라벨을 활용, 우리는 시신경의 호감에서 망막 신경절의 생존과 재생을 연구했다. 결과는 거의 모든 망막 신경절이 살아 망막 신경절의 90 % 이상이 호감 모델 9의 첫 번째 주에 tectum에 재생 보여줍니다.
모두 성공적으로 망막 신경절 레이블을하기 위해, DII 페이스트는 여러 가지 다른 상업용 염료 (10)와 비교 후 선택되었다. 첫째, 특히 생체 조직 라벨링을 위해 설계되었습니다. 둘째, 물을 확산 할 수있는 친 유성 염료이다. 또한,이 형광은 망막 신경절 생존 연구를위한 훌륭한 후보하게 오랫동안 지속 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
망막 신경절의 역행 라벨은 포유류 동물의 망막 신경절의 생존을 연구하는 것이 중요하지만, 제브라 피쉬에서 사용되지 않았습니다. 다른 방법은, 그가 7 염색 및 항체 염색 (8), 망막 신경절의 수를 계산 골드 표준, 표시된 모든 망막 신경절과 유전자 변형 라인하지 않는 것은 아직 12, 13을 구성되지 않았습니다. 이 비디오에서는, 우리는 성인 zebrafish의 망막에 라벨 망막 신…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This is supported by 973 MOST grant (Grant No. 2011CB504402, 2012CB947602), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91132724, U1332136) and the ‘Hundred Talents Project’ of Chinese Academy of Science. The protocol was approved by the Committee on the Ethics of Animal Experiments of the USTC (Permit Number: USTCACUC1103013).
Materials
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521 | USA |
| DiI | Invitrogen | N22880 | USA |
| lightcuring bond | Heraeus Kulzer | Durafill bond | Germany |
| Gluma Etch | Heraeus Kulzer | Gluma Etch 35 Gel | Germany |
| Blue LED | Shenruo Medical Equipment Co. | Power Blue Light Curing Unit | China |
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