定量的光学显微镜：测量细胞生物物理特性与标准光学显微镜
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
我们描述了使用标准的光学显微镜通过明场和微分干涉对比意象的组合来执行质量，体积和密度对细胞样品的定量测量。两种主要的方法都：noninterferometric定量相显微镜（NIQPM），进行总细胞团和亚细胞密度分布的测量，以及希尔伯特变换微分干涉对比显微镜（HTDIC）来确定音量。 NIQPM是基于波传播的简化模型，称为傍轴近似，有三个基本假设：低数值孔径（NA）照明，弱散射光由标本弱吸收。幸运的是，未染色的细胞标本满足这些假设和NA低光照很容易在商业显微镜实现。 HTDIC是用来从下高NA光量的离焦的DIC图像获得体积信息振动性条件。高NA的照明使试样的增强切片沿着光轴。希尔伯特变换处理的DIC图像上叠加大大通过分离从背景的检体强度的灰度值提高边缘检测算法来在三维空间中的样本边界的定位。 NIQPM和HTDIC的主要优势在于他们的技术辅助使用“现成的，现成的”显微镜。有这些方法的两个基本限制：慢Z-堆栈采集时间在商业领域目前废除现象的调查比1帧/分钟的速度更快，其次，衍射效应限制NIQPM和HTDIC的实用程序对象从0.2上升到10 （NIQPM）和20（HTDIC）微米的直径，分别为。因此，感兴趣的试样和其相关联的时间动力学必须满足一定的大小和时间的限制，以便能够使用这些方法。令人兴奋的是，大多数固定cellulař标本很容易调查，这些方法。
Introduction
利用光学显微镜是目前普遍存在于细胞生物的调查。由于在可见光谱的低内源性吸光度和弱散射性质，细胞不强烈影响光波穿过它们的幅度，因此，当与标准的明视场显微镜成像的出现半透明。细胞标本做，但是，减慢光波通过他们行进在该线性关系的局部质量密度的空间，通过该光行进的特定区域的量的方式进行。这种异构的时间滞后或通过显微标本传输光波的“相”配置文件的利用率在1935年首次描述了弗里茨泽尼克1和Zernikein 1942年2实验实现。泽尼克被授予1953年诺贝尔经济学奖的这一成就。蔡司在1945年3商业化这种方式。 1955年，史密斯和Nomarsk我会介绍他们对使用微分干涉对比（DIC）显微镜，使用相位的空间梯度作为对比机制模式4和5的理论初步工作。 DIC是在1965in与诺马斯基6密切合作商业化蔡司。 1981年，两个实验室展示了第一个记录活细胞的DIC图像与视频摄像机纳入DIC显微镜7,8的光学列车。活细胞成像的时代诞生了。
因为这个时候，两个阶段的对比与DIC的商业显微镜的执行在很大程度上是不变的。这些方法由生物学家，主要用于生产细胞图像进行定性用途：监控形态，亚细胞结构的跟踪，动态膜9的调查。这些技术是定性在他们的“现成的，现成的”配置相位和DIÇ图像的光源强度的任意函数，该照明光学部件的设置，以及CCD摄像机增益，γ和曝光设置。
一个小军团物理学家和光学工程师一直在努力做商业成像方式定量。其中第一个努力是两个字母，以自然在1952年和1953年，其中医师出身的生物物理学家罗伯特更加光秃展示了使用相差显微镜的使用市售的相差显微镜通过这些细胞类型估计的相移，以确定细胞的细胞干重10，11。该领域已经开发出了众多围绕三个基本无标记的对比机制在随后几年的技术：相显微镜10,11，DIC显微镜12-17，和明视场18-22以确定光路长度，相位，质量密度，折射率，和细胞体积。
在第llel，收集了大量的自定义光学仪器也已自20世纪50年代开发的，并取得了深远的光学测量范围从虫体增长23应用程序，以记录细胞周期24到调查红细胞25膜动力学。特别是，在过去十年已经看到了大量的无标记定量显微镜的衍射相显微镜26的形式，断层相显微镜27，数字全息显微术28，相位敏感光学相干显微镜29，空间光干涉显微镜30，希尔伯特相差显微镜31，和定量相显微镜32。尽管他们的集体成就，这些仪器没有被分发给由于居多，他们复杂的仪器和计算要求的生物研究人员的大场。
在此我们ð问：描述使用标准光学显微镜通过明场和DIC图像的组合来进行质量，体积和密度对细胞样品的定量测量。两种主要的方法都：noninterferometric定量相显微镜（NIQPM），进行总细胞团和亚细胞密度分布的测量，以及希尔伯特变换微分干涉对比显微镜（HTDIC），以确定音量。 NIQPM和HTDIC的主要优势在于他们的技术可访问性。需要他们的成功执行的成像条件是大部分市售显微镜正常操作范围之内。此外，后处理算法是稳定的，快速的和健壮 – 用尽可能快速傅立叶变换（FFT）的算法在MATLAB已经实现。
NIQPM是一种方法来重构相和CEL的轴向集成的质量密度lular标本从明场图像。此轴向集成质量密度在样品的面积的总和给出了样品的总干质量的内容。该NIQPM协议是基于Paganin和纽金特18,19奠定了实验基础-在它被证明，细胞的相位分布可以从样品通过聚焦亮场图像重建-和弗兰克的理论工作，Altmeyer和韦尼克20 -解决了旁轴波动模型在一个高效的基于FFT的方式。的相位，以干质量密度的连接是通过更加光秃10,11和波佩斯库33基于该工作。
体积信息可以从通过聚焦DIC图像高NA的照明条件下，使试样的光学切片沿着光轴下获得。希尔伯特变换处理的DIC图像堆栈大大提高边缘检测算法来在三维空间中的样本边界，通过分离从背景的检体强度的灰度值的定位。与Arinson 等 34本作品源自虽然我们已经介绍了两种傅里叶滤波方法，以提高对比度和样品的体积自动分析Sobel算子的边缘检测方法。我们在聚苯乙烯球大小不等，从衍射极限可达20微米，直径36也验证HTDIC以前。
尽管这两个NIQPM和HTDIC是由于其在商业显微镜技术的发展方便，该方法是由显微镜本身的硬件配置根本的限制。这些技术的主要局限性是双重的：慢Z堆叠的采集时间在商业领域中，由于对整个样品台的翻译，而不是仅仅在物镜目前限制现象的调查比大约1帧/分钟速度更快，其次，衍射效应限制NIQPM和HTDIC的实用程序对象大小不等，从0.2上升到10和20微米，直径分别。因此，感兴趣的样品及其相关的动态时间必须达到一定的规模和时间上的限制，使典型的“现成的，现成的”工具使用这些方法。令人兴奋的是，大多数固定细胞标本很容易调查，这些方法。
该NIQPM和HTDIC协议的概述示于图1。在图2中 ，我们说明了最优和次优通过聚焦成像低和高NA的照明条件下为亮场和DIC图像。 图3和图4展示了参数NIQPM算法的依赖性突出成功的和不成功的实现。 <strong>图5示出涉及HTDIC图像处理算法的步骤和说明了最佳实施的算法，以确定细胞的体积。
Protocol
Representative Results
Discussion
在一般情况下，NIQPM是验证的光路长度从0.25-44.7受衍射限制的技术。验证了n个执行= 1.596聚苯乙烯球从0.11-9.8微米的悬浮在Fluoromount摹直径范围（数据未显示）。细胞具有光路长度，范围从近0-7。
当测量试样的密度分布人们可以发现，伪DIC图像看起来很好，而密度地图拥有多余的背景贡献。这是由于在作为输入到NIQPM算法的样本的亮场图像的噪声。两个可能的修改，NIQPM方法可?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由美国国立卫生研究院（U54CA143906到KGP，OJTM和R01HL101972到OJTM）和俄勒冈州医学研究基金会早期临床研究奖（KGP）资助。 OJTM是美国心脏协会研究者（13EIA12630000）。我们感谢奈特癌症研究所的埃里克·安德森博士准备在这项工作中使用的细胞样本。
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
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