Kvantitative optisk mikroskopi: Måling af Cellular Biophysical Features med en standard optisk mikroskop

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Vi beskriver brugen af ​​en standard optisk mikroskop til at udføre kvantitative målinger af masse, volumen og densitet på cellulære prøver gennem en kombination af lys felt og differentieret interferens kontrast billedsprog. To primære tilgange præsenteres: noninterferometric kvantitativ fase mikroskopi (NIQPM), til at udføre målinger af total cellemasse og subcellulære tæthed distribution og Hilbert omdanne differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) for at bestemme lydstyrken. NIQPM er baseret på en forenklet model af bølgeudbredelse, kaldet paraksiale tilnærmelse, med tre underliggende antagelser: lav numerisk blænde (NA) belysning, svag spredning og svag absorption af lys ved prøven. Heldigvis ufarvede cellulære prøver opfylde disse antagelser og lav NA belysning opnås let på kommercielle mikroskoper. HTDIC anvendes til at opnå volumetrisk oplysninger fra gennemgående fokus DIC billedsprog under højt NA Illumination forhold. Høj NA belysning muliggør udvidet sektionering af prøven langs den optiske akse. Hilbert omdanne behandling på DIC billedet stakke i høj grad øger kantdetektering algoritmer til lokalisering af prøven grænser i tre dimensioner ved at adskille de grå værdier af modellen intensiteten fra dem af baggrunden. De primære fordele ved NIQPM og HTDIC lå i deres teknologiske tilgængelighed ved hjælp af "off-the-shelf" mikroskoper. Der er to grundlæggende begrænsninger af disse metoder: langsom z-stak erhvervelse tid på kommercielle Scopes øjeblikket ophæver undersøgelse af fænomener hurtigere end 1 frame / minut, og for det andet, diffraktion effekter begrænser nytten af ​​NIQPM og HTDIC til objekter fra 0,2 op til 10 (NIQPM) og 20 (HTDIC) um i diameter, hhv. Derfor skal prøven og dens tilhørende tids dynamik interesse mødes vis størrelse og tidsmæssige begrænsninger for at aktivere brugen af ​​disse metoder. Spændende, mest fast cellulaR Enheder let undersøgt med disse metoder.

Introduction

Brugen af ​​optisk mikroskopi er nu er allestedsnærværende i undersøgelse af cellulære organismer. På grund af deres lave endogene absorbans og svag spredende egenskaber i forhold til det synlige optiske spektrum, kan cellerne ikke kraftigt påvirke amplituden af ​​optiske bølger gennemkører og således synes semitransparent når afbildes med standard lyse felt mikroskoper. Cellular prøver er dog bremse optiske bølger rejser gennem dem på en måde, som er lineært relateret til mængden af ​​lokale massefylde i et bestemt område af rummet, hvorigennem lyset bevæger sig. Udnyttelse af denne heterogene forsinkelse eller "fase" profil af optiske bølger transmitteres gennem mikroskopiske prøver blev første gang beskrevet i 1935 af Frits Zernike ¹ og eksperimentelt realiseret ved Zernikein 1942 ^2. Zernike blev tildelt Nobelprisen i 1953 for denne præstation. Zeiss kommercialiseret denne modalitet i 1945 ^3. I 1955 Smith og NomarskJeg vil præsentere deres indledende arbejde vedrørende anvendelse ⁴ og teori ⁵ af differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi, en modalitet, der bruger den rumlige gradient af fase som en kontrast mekanisme. DIC blev kommercialiseret af Zeiss i 1965in tæt samarbejde med Nomarski ^6. I 1981 to laboratorier viste den første optaget live celle DIC billedsprog med indarbejdelsen af videokameraer i optik toget af DIC mikroskop ^{7, 8.} Den æra af levende celler blev født.

Siden dette tidspunkt har udførelsen af ​​både fasekontrast og DIC på kommercielle mikroskoper stort set været uændret. Disse metoder er hovedsagelig anvendes af biologer til at producere billeder af celler til kvalitative formål: overvågning af morfologi, sporing af subcellulære strukturer, og undersøgelser af membran dynamik ^9. Disse teknikker er kvalitative i deres "off-the-shelf" konfiguration som både fase og DIC-billeder er vilkårlige funktioner af lyskilden intensitet, belysningsoptikken indstillinger og CCD-kamera gain, gamma og eksponering indstillinger.

En lille hær af fysikere og optiske ingeniører har forsøgt at gøre kommercielle billeddiagnostiske modaliteter kvantitativ. Blandt de første indsats var to breve til naturen i 1952 og 1953, hvor lægen-turned-biofysiker Robert Barer demonstreret brugen af fase mikroskopi for at bestemme cellulær tørvægt af celler ved at anslå faseskift gennem disse celletyper ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt fase mikroskop ^{10, 11.} Feltet har udviklet et væld af teknikker end de efterfølgende år baseret omkring tre grundlæggende label-fri kontrast mekanismer: fasemikroskopi ^10,11, DIC mikroskopi ^12-17, og lyse felt ^18-22 for at bestemme optisk vejlængde, fase, masse densitet, brydningsindeks og cellulære volumen.

I parallel, har en stor samling af brugerdefinerede optiske instrumenter også blevet udviklet siden 1950'erne, og har gjort vidtrækkende optiske målinger lige fra applikationer i parasit vækst ^23, at dokumentere cellecyklus ²⁴ til at undersøge membran dynamik røde blodlegemer ^25. Især har de seneste ti år set et væld af etiket-fri kvantitativ mikroskopi i form af diffraktion fasemikroskopi ^26, tomografisk fasemikroskopi ^27, digital holografisk mikroskopi ^28, fasesensitiv optisk kohærens mikroskopi ^29, rumlig mikroskopi lys indblanding ^30, Hilbert fasemikroskopi ^31, og kvantitativ fasemikroskopi ^32. På trods af deres kollektive succeser, har disse instrumenter ikke er blevet formidlet til de større område af biologiske forskere grund, for det meste, at deres komplekse instrumentering og beregningsmæssige krav.

Heri vi describe brugen af ​​en standard optisk mikroskop til at udføre kvantitative målinger af masse, volumen og densitet på cellulære prøver gennem en kombination af lys felt og DIC billedsprog. To primære fremgangsmåder er præsenteret: noninterferometric kvantitativ fasemikroskopi (NIQPM), til at udføre målinger af totale cellemasse og subcellulær tæthed distribution og Hilbert transformation differential interferens kontrast mikroskopi (HTDIC) for at bestemme volumen. De primære fordele ved NIQPM og HTDIC lå i deres teknologiske tilgængelighed. De billeddiagnostiske betingelser for deres vellykkede gennemførelse ligger inden for rammerne af normal drift af de fleste kommercielt tilgængelige mikroskoper. Derudover post-algoritmer er stabile, hurtig og robust – der er blevet implementeret i MATLAB hjælp af Fast Fourier transformation (FFT) baserede algoritmer når det er muligt.

NIQPM er en metode til at rekonstruere fase og den aksialt integreret massefylde cellular prøver fra lyse felt billedsprog. Opsummering af denne aksialt integreret massefylde over det område af prøven giver det totale tørstofindhold af prøven masse. Den NIQPM Protokollen er baseret på de eksperimentelle fundament lagt af Paganin og Nugent ^{18, 19} – hvori det blev påvist, at den fase profil af en celle kunne rekonstrueres fra gennemgående fokus lyse felt billedsprog af prøven – og det teoretiske arbejde, Frank , Altmeyer og Wernicke ²⁰ – om at løse de paraksiale bølge modellerne på en effektiv FFT-baserede måde. Tilslutningen af fase til den tørre massefylde er baseret på arbejde af Barer ^{10, 11} og Popescu ^33..

Volumetrisk oplysninger kan fås ved henvendelse gennem fokus DIC billedsprog under høje NA lysforhold, der muliggør optisk sektionering af prøven langs den optiske akse. Hilbert omdanne behandling på DIC billedstakke høj grad øgerflankeidentificering algoritmer til lokalisering af prøven grænser i tre dimensioner ved at adskille de grå værdier af modellen intensitet fra de af baggrunden. Dette arbejde stammer med Arinson et al. ³⁴ selvom vi har indført både Fourier filtrering metoder til at forbedre kontrast og en Sobel-baserede kantdetektering metode til automatiseret volumetrisk analyse af prøven. Vi har også valideret HTDIC tidligere på polystyren kugler varierer i størrelse fra diffraktion grænsen op til 20 um i diameter ^36.

Mens både NIQPM og HTDIC er teknologisk tilgængelige på grund af deres udvikling på kommercielle mikroskoper, er de metoder, der fundamentalt begrænset af den hardware konfiguration af mikroskoper selv. De primære begrænsninger af disse teknikker er dobbelt: slow z-stak erhvervelse tid på kommercielle anvendelsesområder, på grund af oversættelse af hele prøven scenen i modsætning til blot objektivlinsenBegrænser i øjeblikket undersøgelsen af ​​fænomener hurtigere end omkring 1 ramme / minut, og for det andet diffraktionseffekter begrænse nytten af ​​NIQPM og HTDIC genstande spænder i størrelse fra 0,2 op til 10 og 20 um i diameter, hhv. Derfor skal prøven og tilhørende tid dynamik af interesse mødes vis størrelse og tidsmæssige begrænsninger for at muliggøre anvendelsen af ​​disse metoder på typiske "off-the-shelf" instrumenter. Spændende er de fleste faste cellulære prøver let undersøgt med disse metoder.

En oversigt over NIQPM og HTDIC protokoller er givet i figur 1. I figur 2 illustrerer vi optimal og suboptimal gennem fokus billeddannelse under både lave og høje NA lysforhold for både lyse felt og DIC billedsprog. Figur 3 og 4 demonstrere parameter afhængighed af NIQPM algoritmen fremhæve vellykkede og mislykkede implementeringer. <strong> Figur 5 illustrerer de trin, der er involveret i HTDIC billedbehandling algoritme og demonstrerer optimal gennemførelse af algoritme til at bestemme cellulær volumen.

Protocol

1.. Mikroskop Specifikationer At udføre billedbehandling i den korrekte måde mikroskop skal have følgende specifikationer: Besidder både kontrast differential interferens (DIC) og lysfelt (BF) kontrast. Har computer-kontrollerede z-aksen bevægelse. Har en justerbar blænde stop for at variere kondensatorlinseenheden numeriske åbning. En åbning med en gradueret regel eller elektronisk udlæsning ønskes at kende værdien af ​​den numeriske åbning. De…

Representative Results

Korrekt prøve belysning under billedet erhvervelse gennemgående fokus er afgørende for en vellykket gennemførelse af NIQPM en nd HTDIC algoritmer. I figur 2 illustrerer vi lav og høj NA belysning under både DIC og lyse felt kontrast til en polystyren kugle og den menneskelige kolorektal adenocarcinomcellelinie SW620. 2A, 2C, 2I, og 2K demonstrere optimal billeddannelse til NIQPM. Figurerne 2F, 2H, 2N, og 2P demons…

Discussion

Generelt NIQPM er en diffraktionsbegrænset teknik valideret på optiske sti-længder der spænder fra 0,25 til 44,7. Validering udførtes på n = 1,596 polystyrenkugler varierer i diameter fra 0,11 til 9,8 um suspenderet i Fluoromount G (data ikke vist). Celler besidder optiske sti-længder, der spænder fra næsten 0-7.

Ved måling af tæthed fordeling af en prøve kan man finde, at den pseudo DIC billedet ser fint, mens tætheden kortet besidder uønskede baggrund bidrag. Dette er på gru…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media