Microscopie optique quantitative: mesure de biophysique cellulaire Caractéristiques avec un microscope optique standard

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Nous décrivons l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume et la densité sur des échantillons cellulaires grâce à une combinaison de champ lumineux et contraste d'interférence différentiel imagerie. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC) pour déterminer le volume. NIQPM est basé sur un modèle simplifié de propagation de l'onde, appelée l'approximation paraxiale, avec trois hypothèses sous-jacentes: faible ouverture numérique (NA), éclairage faible diffusion, et la faible absorption de la lumière par l'échantillon. Heureusement, les échantillons cellulaires non colorées répondent à ces hypothèses et un éclairage faible NA est facile à réaliser sur des microscopes commerciaux. HTDIC est utilisé pour obtenir des informations volumétrique de par-focus DIC imagerie sous haute illumin NAconditions ation. Illumination NA élevé permet une meilleure découpe de l'éprouvette le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert de traitement sur l'image DIC empile améliore considérablement les algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimen en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles du fond. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique utilisant des microscopes "off-the-shelf". Il existe deux principales limitations de ces méthodes: lente z-stack temps d'acquisition sur les étendues commerciales abroge actuellement l'enquête de phénomènes plus rapidement que 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets de 0,2 à 10 (NIQPM) et 20 (HTDIC) um de diamètre, respectivement. Par conséquent, les spécimens et son temps associé dynamique d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes. Excitant, cellula plus fixespécimens r sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Introduction

L'utilisation de la microscopie optique est désormais omniprésent dans l'enquête des organismes cellulaires. En raison de leur faible absorption et faible diffusion propriétés endogènes sur le spectre optique visible, les cellules n'affectent pas fortement l'amplitude des ondes optiques qui les traversent et donc apparaissent semi quand imagé avec des microscopes de champ lumineux standard. Échantillons cellulaires font, cependant, ralentissent ondes optiques qui transitent par eux d'une manière qui est linéairement liée à la quantité de masse volumique locale dans une région particulière de l'espace à travers lequel la lumière se déplace. L'utilisation de ce laps de temps hétérogènes ou profil "en phase" d'ondes optiques transmis à travers les échantillons microscopiques a été décrite pour la première en 1935 par Frits Zernike ¹ et expérimentalement réalisée par Zernikein 1942 ^2. Zernike a reçu le prix Nobel en 1953 pour cette réalisation. Zeiss commercialisé cette modalité en 1945 ^3. En 1955, Smith et Nomarski souhaite présenter leurs travaux initiaux sur l'utilisation ⁴ et ⁵ théorie de contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, une modalité qui utilise le gradient spatial de phase en tant que mécanisme de contraste. DIC a été commercialisé par Zeiss en 1965in étroite collaboration avec Nomarski ^6. En 1981, deux laboratoires ont démontré la première enregistrée cellules vivantes DIC imagerie avec l'incorporation de caméras vidéo dans le train optique du microscope DIC ^{7, 8.} L'ère de l'imagerie des cellules vivantes est né.

Depuis ce temps, l'exécution de deux à contraste de phase et DIC sur microscopes commerciaux a été largement inchangé. Ces méthodes sont principalement utilisées par les biologistes pour produire des images de cellules à des fins qualitatives: la surveillance de la morphologie, le suivi des structures sous-cellulaires, et les enquêtes de la dynamique de la membrane ^9. Ces techniques sont d'ordre qualitatif dans leur configuration "off-the-shelf" que la phase et DIC images sont des fonctions arbitraires de l'intensité de la source lumineuse, les paramètres optiques d'éclairage, et le gain de la caméra CCD, gamma, et les paramètres d'exposition.

Une petite légion de physiciens et d'ingénieurs optiques s'est efforcé de modalités d'imagerie quantitative commerciales. Parmi les premiers efforts étaient deux lettres à la nature en 1952 et 1953 où le médecin devenu biophysicien Robert Barer démontré l'utilisation de la microscopie de phase pour déterminer la masse sèche cellulaire des cellules en estimant déphasages par ces types de cellules en utilisant un microscope de phase disponible dans le commerce ^{10, 11.} Le champ a développé une multitude de techniques au cours des années qui ont suivi articulés autour de trois mécanismes de contraste de base sans étiquette: microscopie de phase ^10,11, DIC microscopie ^12-17, et sur ​​le terrain lumineux ^18-22 pour déterminer chemin optique de longueur, la phase, la masse densité, indice de réfraction, et le volume cellulaire.

Au paragraphellèle, une grande collection d'instruments optiques personnalisées ont également été développés depuis les années 1950, et ont consenti des mesures optiques allant des applications à la croissance du parasite ^23, à la documentation du cycle cellulaire ²⁴ d'enquêter sur la dynamique des membranes de globules rouges ^25. En particulier, les dix dernières années ont vu une multitude de microscopie quantitative sans étiquette sous la forme de microscopie de phase de diffraction ^26, la microscopie de phase tomographique ^27, la microscopie holographique numérique ^28, phase délicate microscopie par cohérence optique ^29, spatiale interférence de lumière microscopie ^30, Hilbert phase de microscopie ^31, et la microscopie de phase quantitative ^32. Malgré leurs réussites collectives, ces instruments n'ont pas été diffusés dans le domaine plus large de chercheurs biologiques en raison, principalement, de leur instrumentation complexe et les exigences de calcul.

Ici, nous Describe l'utilisation d'un microscope optique standard pour effectuer des mesures quantitatives de la masse, le volume, la densité et sur des échantillons cellulaires à travers une combinaison de champ lumineux et l'imagerie DIC. Deux approches principales sont présentées: noninterferometric microscopie de phase quantitatif (NIQPM), d'effectuer des mesures de la masse cellulaire totale et de la distribution subcellulaire de la densité, et la transformée de Hilbert différentiel microscopie à contraste interférentiel (HTDIC), pour déterminer le volume. Les principaux avantages de NIQPM et HTDIC pondent dans leur accessibilité technologique. Les conditions de formation d'image nécessaire à la bonne exécution entrent dans le cadre du fonctionnement normal de la plupart des microscopes disponibles dans le commerce. En outre, les algorithmes de post-traitement sont stables, rapide et robuste – ayant été mis en œuvre dans MATLAB en utilisant la transformée algorithmes (FFT) sur la base de Fourier rapide chaque fois que possible.

NIQPM est un procédé pour reconstruire la phase et la densité de la masse axialement intégré de celspécimens lular à partir d'images de champ lumineux. Sommation de cette masse volumique axialement intégrée sur la surface de l'échantillon donne la teneur en masse sèche totale de l'éprouvette. Le protocole de NIQPM repose sur les fondations expérimentales définies par Paganin et Nugent ^{18, 19} – dans lequel il a été démontré que le profil de phase d'une cellule peut être reconstruit à partir traversant focalisation champ lumineux imagerie de l'échantillon – et le travail théorique de Frank , Altmeyer, et Wernicke ²⁰ – sur la résolution des modèles de vagues parallèles à l'axe d'une manière efficace par FFT. La connexion de la phase de la densité de la masse sèche est basée sur les travaux de Barer ^{10, 11} et ³³ Popescu.

Volumétrique informations peuvent être obtenues à partir des images de mise au point à travers DIC dans des conditions d'illumination NA élevées qui permettent sectionnement optique de l'échantillon le long de l'axe optique. Transformée de Hilbert traitement sur les piles d'images DIC améliore grandementLes algorithmes de détection de bord pour la localisation de la frontière spécimens en trois dimensions en séparant les valeurs de gris de l'intensité de l'échantillon à partir de celles de l'arrière-plan. Ce travail émane de Arinson et al. ³⁴ bien que nous avons mis en place deux méthodes de filtrage de Fourier pour améliorer le contraste et d'une méthode de détection bord à base de Sobel pour l'analyse automatique volumétrique de l'échantillon. Nous avons également validé HTDIC précédemment sur ​​des sphères de polystyrène d'une taille allant de la limite de diffraction de 20 um de diamètre ^36.

Bien que les deux NIQPM HTDIC et sont accessibles sur le plan technologique à cause de leur développement sur les microscopes commerciaux, les procédés sont fondamentalement limitées par la configuration matérielle des microscopes eux-mêmes. Les principales limites de ces techniques sont de deux ordres: lente z-stack temps d'acquisition sur des champs commerciaux, en raison de la traduction de l'étape de la totalité de l'échantillon plutôt que de simplement l'objectif, Limite actuellement l'étude des phénomènes plus rapidement que d'environ 1 image / minute, et d'autre part, des effets de diffraction limitent l'utilité de NIQPM et HTDIC à des objets d'une taille allant de 0,2 à 10 et 20 m de diamètre, respectivement. Ainsi, l'échantillon et de sa dynamique de temps associées d'intérêt doivent répondre à certaine taille et des contraintes temporelles pour permettre l'utilisation de ces méthodes sur les instruments typiques "off-the-shelf". Passionnante, la plupart des spécimens cellulaires fixes sont facilement étudiées avec ces méthodes.

Un aperçu de la NIQPM et protocoles HTDIC sont donnés dans la figure 1. Dans la figure 2, nous illustrons l'imagerie optimale et sous-optimale par-focus dans des conditions d'éclairage à la fois basse et haute NA pour les deux champs lumineux et imagerie DIC. Figures 3 et 4 montrent le paramètre dépendance de l'algorithme de NIQPM soulignant implémentations réussies ou non. <strong> Figure 5 illustre les étapes de l'algorithme de traitement d'image HTDIC et démontre la mise en œuvre optimale de l'algorithme pour déterminer le volume cellulaire.

Protocol

Une. Microscope Spécifications Pour faire de l'imagerie dans le bon mode microscope devrait avoir les caractéristiques suivantes: Posséder à la fois contraste interférentiel différentiel (DIC) et fond clair (BF) contraste. Avoir un mouvement d'axe z commandé par ordinateur. Avoir un diaphragme d'ouverture réglable pour faire varier l'ouverture numérique de la lentille de condenseur. Une ouverture avec une règle graduée ou lecture éle…

Representative Results

Corriger éclairage de l'échantillon lors de l'acquisition de l'image par-focus est essentielle à la mise en œuvre réussie de la NIQPM un Algorithmes HTDIC nd. Dans la figure 2, nous illustrons éclairage basse et haute NA sous deux DIC et lumineux contraste de champ pour une sphère de polystyrène et le colorectal ligne de cellules d'adénocarcinome humain SW620. Figures 2A, 2C, 2I, et 2K démontrent imagerie optimale pour NIQPM. <…

Discussion

En général, NIQPM est une technique de diffraction limitée validée sur le chemin optique des longueurs allant de 0,25 à 44,7. La validation a été effectuée sur n = 1,596 sphères de polystyrène de diamètre allant de 0,11 à 9,8 um en suspension dans Fluoromount G (données non présentées). Les cellules possèdent chemin longueurs optiques qui vont de près de 0-7.

Lorsque la mesure de la distribution de la densité d'un échantillon, on peut constater que l'image de pseud…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media