양이 광학 현미경 : 세포 생물 물리학의 측정​​ 표준 광학 현미경과 특징

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

우리는 밝은 필드와 미분 간섭 콘트라스트 이미지의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경을 사용하는 방법을 설명한다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하는 차동 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. 낮은 개구 수 (NA) 조명, 약한 산란 및 표본에 의한 빛의 약한 흡수 : NIQPM는 전파의 단순화 된 모델을 기반으로, 세 가지 기본 가정으로, 근축 근사라고합니다. 다행히, 흠없는 세포 표본은 이러한 가정을 만족하는 낮은 NA 조명 쉽게 상용 현미경에 달성된다. HTDIC 높은 NA의 illumin 아래를 통해 초점 DIC 이미지에서 체적 정보를 얻는 데 사용됩니다ATION 조건. 높은 NA 조명 광축을 따라 시험편의 향상된 절편을 가능하게한다. 힐버트 DIC 이미지를 변환 처리가 크게 스택 배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 현지화 에지 검출 알고리즘을 향상시킵니다. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 "기성품"현미경을 사용하여 자신의 기술 접근​​성에 누워. 상용 범위에 느린 Z-스택 획득 시간은 빨리 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 abrogates, 둘째, 회절 효과는 최대 10 0.2에서 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유용성을 제한하는 이러한 방법의 두 가지 기본 제한이 있습니다 각각 (NIQPM) 직경 20 (HTDIC) μm의. 따라서, 그 시험편과 연관된 시간 역학 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기 및 시간 제약을 충족시켜야한다. 호쾌하게, 대부분의 고정 cellula연구 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.

Introduction

광학 현미경의 사용은 이제 세포 생물의 조사에 유비 쿼터스입니다. 때문에 가시 광 스펙트럼을 통해 자신의 낮은 내생 흡수 약한 산란 특성에, 세포는 강하게을 통과하는 광 파의 진폭에 영향을 미치고, 따라서 표준 밝은 필드 현미경으로 몇 군데 때 반투명 표시되지 않습니다. 셀룰러 시험편은, 그러나, 선형 광이 이동하는 공간을 통해 특정 영역에있는 로컬 질량 밀도의 양에 관련된 방법들을 통해 여행 광파를 느리게 않는다. 이 이기종 시간 지연 또는 현미경 표본을 통해 전송 광 파도의 "단계"프로파일의 활용 먼저 프리츠 제르 니케 ^(1)에 의해 1935 년에 기술 된 실험적 Zernikein 1942 ^(2)에 의해 실현되었다. 니케는 이러한 성과에 대해 1953 년 노벨상을 수상했다. 혈구 1945 년 ^3이 양상을 상용화. 1955 년 스미스와 Nomarsk내가 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경, 반대로기구로서 위상의 공간 구배를 사용하는 양상의 사용 ^{4와 5의} 이론에 자신의 초기 작품을 것입니다. DIC는 노멀 스키 ⁶ 1965in 긴밀한 협력 혈구에 의해 상용화되었다. 1981 년, 두 연구소는 DIC 현미경 ^{7, 8의} 광학 기차에 비디오 카메라의 장착으로 처음으로 기록 된 살아있는 세포 DIC 이미지를 보여 주었다. 라이브 세포 이미징의 시대가 탄생했습니다.

이 시간 이후, 상업 현미경에 위상 콘트라스트 및 DIC 모두의 실행은 큰 변화가 있었다. 형태, 세포 내 구조의 추적 및 멤브레인 역학 ^9의 조사 모니터링 :이 방법은 주로 정성적인 목적을 위해 세포의 이미지를 생산하는 생물 학자들에 의해 사용된다. 이 기술은 위상과 DI 모두 그들의 "기성"구성에서 질적C 이미지는 임의의 광원 강도의 함수, 조명 광학계 설정 및 CCD 카메라 이득, γ, 및 노출 설정이다.

물리학 자 및 광학 엔지니어의 작은 군단 상업 영상 기법으로 정량적하기 위해 노력하고있다. 첫 번째 노력 중 의사 출신 생물 물리학 자 로버트 Barer 시중에서 위상 현미경을 사용하여 이러한 종류의 세포를 통해 위상 변화를 추정하여 세포의 세포 건조 질량을 결정하는 위상 현미경의 사용을 입증하는 1952 년 1953 년 자연에 두 글자가 있었다 ^{10, 11.} 위상 현미경 ^{10, 11,} DIC 현미경 ^12-17, 광학 경로 길이, 상, 질량을 결정하는 시야 ^{18 ~ 22} : 필드는 세 가지 기본 레이블이없는 반면 메커니즘을 기반으로 다음의 몇 년 동안 기술의 다수를 개발했다 밀도, 굴절률, 및 셀룰러 볼륨.

파라의llel, 사용자 정의 광학 기기의 큰 컬렉션은 1950 년대부터 개발되었으며, 기생충의 성장 ⁽²³⁾ 응용 프로그램에서, 적혈구 ^(25)의 막 역학 조사에 세포주기 ^(24)를 문서화에 이르기까지 광학 측정 광범위한 만들었습니다. 특히, 지난 10 년 회절 위상 현미경 ^(26)의 형태, 단층 위상 현미경 ^(27), 디지털 홀로그램 현미경 ²⁸ 단계 민감한 빛 간섭 현미경 ^29, 공간 광 간섭 현미경 ^(30), 힐버트에 라벨이없는 양적 현미경의 부를 볼 수있다 위상 현미경 ^31, 정량적 위상 현미경 ^32. 그들의 집단의 성공에도 불구하고,이 악기는 복잡한 장비 및 전산 요구 사항을 대부분, 때문에 생물학적 연구의 큰 분야에 전파되지 않았습니다.

여기에서 우리는 거라고명 시야 및 DIC 이미지에서의 조합을 통해 질량, 부피, 및 세포 검체에 대한 밀도의 정량 측정을 수행하기 위해 표준 광학 현미경의 사용을 방접원을 그리다. 두 가지 주요 접근법이 제시된다 : noninterferometric 정량적 위상 현미경 (NIQPM)는 전체 세포 덩어리 및 세포 내 밀도 분포의 측정을 수행하고, 힐버트 볼륨을 결정하기 위하여, 미분 간섭 콘트라스트 현미경 (HTDIC)을 변형. NIQPM 및 HTDIC의 주요 장점은 자신의 기술 접근​​성에 누워. 성공적인 실행에 필요한 촬상 조건은 대부분 시판 현미경의 정상 작동 범위 내에있다. 또한, 포스트 – 프로세싱 알고리즘이 안정된 퀵하고 견고 – 가능한 고속 푸리에 변환 (FFT) 기반 알고리즘을 사용하여 변환 MATLAB에서 구현 된 것으로.

NIQPM 위상 및 CEL의 축 방향으로 집적 질량 밀도를 재구성하는 방법시야 이미지에서 lular 표본. 시험편의 면적 이상이 축 방향으로 집적 질량 밀도의 합산 시편의 총 건조 물질 함량을 준다. 이 셀의 위상 프로파일이 샘플을 통해 초점 시야 이미지에서 재구성 될 수 있다는 것을 입증되었던 – – NIQPM 프로토콜 Paganin 및 전트 ^{(18, 19)에} 의해 마련 실험적 토대에 기반하고 프랭크의 이론적 작품 , Altmeyer과 베르 니케 ²⁰ – 효율적인 FFT 기반 방식으로 근축 파 모델을 해결하십시오. 건조 질량 밀도상의 연결 Barer ^{10, 11} 및 페스 쿠 ^(33)에 의해 워크에 기초한다.

체적 정보는 광축을 따라 시험편의 광학 절편을 활성화 높은 NA 조명 조건 하에서 관통 포커스 DIC 이미지에서 얻을 수있다. 힐버트 DIC 이미지 스택에서 변환 처리를 크게 향상배경의 사람들의 표본 강도의 회색 값을 구분하여 세 가지 차원에서 표본 국경의 지역화를위한 에지 검출 알고리즘. 우리가 대조 샘플의 자동화 된 체적 분석을위한 기반 소벨 에지 검출 방법을 향상시키기 위해 두 푸리에 필터링 방법을 도입하고 있지만이 작품 Arinson 외. ³⁴ 유래. 우리는 또한 회절 한계에서 최대 직경이 ^36에서 20 μm의 크기에 이르기까지 폴리스티렌 분야에서 이전에 HTDIC을 확인했다.

NIQPM 및 HTDIC 모두 상용 현미경에 자신의 발전으로 인하여 기술적으로 액세스 할 수 있지만, 방법은 근본적 현미경 자체의 하드웨어 구성에 의해 제한된다. 이러한 기술의 주요 제한은 두 가지이다 : 반대로 인해 전체 시료 스테이지의 변환에, 상업용 스코프 느린 Z-스택 획득 시간 그대로 대물 렌즈를 행현재 빠른 약 1 프레임 / 분 이상 현상의 조사를 제한하고 둘째, 회절 효과는 각각 직경 10, 20 μm의 0.2에서 크기에 이르기까지 개체에 NIQPM 및 HTDIC의 유틸리티를 제한합니다. 따라서 관심의 표본과 관련 시간의 역학은 일반적으로 "기성"악기에 이러한 방법의 사용을 가능하게하기 위해 특정 크기와 시간 제약 조건을 충족해야합니다. 호쾌하게, 대부분의 고정 된 세포 표본은 쉽게 이러한 방법으로 조사 하였다.

NIQPM 및 HTDIC 프로토콜의 개요를 그림 1에 나타내었다. 도 2에서 우리는 시야 및 DIC 이미징 모두 낮고 높은 두 NA 조명 조건 하에서 최적 및 차선 관통 포커스 이미징을 도시한다. 3,4 성공 및 실패의 구현을 강조 NIQPM 알고리즘의 파라미터 의존성을 보여 피규어. <strong>도 5는 HTDIC 화상 처리 알고리즘에 관련된 단계를 도시 및 세포 용적을 결정하는 알고리즘의 최적 구현을 보여준다.

Protocol

1. 현미경 사양 올바른 방식으로 이미징을 수행하기 위해 현미경은 다음과 같은 사양을 가지고 있어야합니다 : 미분 간섭 대비 (DIC) 및 시야 (BF) 대비 모두를 가지고있다. 컴퓨터로 제어되는 Z 축 이동을해야합니다. 집광 렌즈의 개구 수를 변경하는 조절 조리개가 있습니다. 등급 판정 규칙 또는 전자 판독 가진 조리개 개구 수의 값을 알 필요가있다. 개?…

Representative Results

를 통해 초점 이미지 수집하는 동안 올바른 샘플 조명 NIQPM 차 HTDIC 알고리즘의 성공적인 구현에 매우 중요합니다. 그림 2에서 우리는 DIC와 폴리스티렌 구와 인간의 대장 선암 세포주 SW620에 대한 시야 대비 모두에서 낮은 높은 NA 조명을 보여줍니다. 2A 피규어, 2C, 2I, 그리고 2K가 NIQPM에 대한 최적의 영상을 보여줍니다. 2 층 2H 피규어, 2N 및 2P는 HTDIC?…

Discussion

일반적으로, NIQPM는 0.25-44.7에 이르기까지 광학 경로 길이에 대한 유효성을 검사 회절 제한 기술이다. 유효성 검사가 N에서 수행 하였다 = Fluoromount G 현탁 0.11-9.8 μM에서 직경 이르는 1.596 폴리스티렌 구체 (데이터는 도시되지 않음). 세포는 거의 0-7 범위의 광학 경로 길이를 가지고있다.

시편의 밀도 분포를 측정 할 때 하나는 밀도지도 원치 않는 기여를 보유하는 동안 의사 DIC ?…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media