Microscopia ótica quantitativa: Measurement of Cellular Biofísica Características com um microscópio óptico padrão

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Descreve-se o uso de um microscópio ótico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo brilhante e diferencial interferência imagens de contraste. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC) para determinar volume. NIQPM baseia-se um modelo simplificado de propagação da onda, denominado aproximação paraxial, com três suposições: baixa abertura numérica (NA) de iluminação, a dispersão fraca, e fraca absorção de luz pela amostra. Felizmente, as amostras celulares não coradas satisfazer estes pressupostos e baixa iluminação NA é facilmente alcançada em microscópios comerciais. HTDIC é usado para obter informações volumétrica a partir de imagens através de foco DIC sob alta ilumin NAcondições ation. Iluminação elevada NA permite melhor corte da amostra ao longo do eixo óptico. Transformada de Hilbert da transformação na imagem DIC empilha aumenta muito algoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica utilizando microscópios "off-the-shelf". Existem duas limitações básicas destes métodos: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais ab-roga atualmente a investigação dos fenômenos mais rápido do que um frame / minuto, e em segundo lugar, os efeitos de difração de restringir a utilidade da NIQPM e HTDIC a objetos de 0,2 até 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) um de diâmetro, respectivamente. Assim, os espécimes e o seu tempo associado dinâmica de interesse deve satisfazer certos restrições de tamanho e temporais, para permitir o uso de tais métodos. Empolgante, a cellula mais fixor espécimes são prontamente investigadas com estes métodos.

Introduction

O uso de microscopia óptica é agora onipresente na investigação de organismos celulares. Devido ao seu baixo de absorção e de espalhamento fraco propriedades endógenas mais visível do espectro óptico, as células não afetam fortemente a amplitude de ondas ópticas atravessando-los e, assim, aparecer semitransparente quando fotografada com microscópios de campo brilhante padrão. Amostras celulares, no entanto, diminuir ondas ópticas viajam através deles de uma forma que é linearmente relacionada com a quantidade de densidade de massa local em uma determinada região do espaço através do qual a luz viaja. A utilização desse intervalo de tempo heterogêneo ou perfil "fase" de ondas ópticas transmitidos através espécimes microscópicas foi descrita pela primeira vez em 1935 por Frits Zernike ¹ e experimentalmente realizado por Zernikein 1942 ^2. Zernike foi agraciado com o prêmio Nobel em 1953 por essa conquista. Zeiss comercializado esta modalidade em 1945 ^3. Em 1955, Smith e NomarskGostaria de apresentar o seu trabalho inicial sobre o uso ^{de 4} e ⁵ de teoria de interferência diferencial contraste (DIC) de microscopia, uma modalidade que utiliza o gradiente espacial de fase como um mecanismo de contraste. DIC foi comercializado por Zeiss em 1965in estreita colaboração com Nomarski ^6. Em 1981, dois laboratórios demonstraram a primeira célula viva imagens DIC registada com a incorporação de câmaras de vídeo para o trem óptica do microscópio DIC ^{7, 8.} A era das imagens de células vivas nasceu.

Desde essa altura, a execução de ambos de contraste de fase e DIC em microscópios comerciais tem sido largamente inalterada. Estes métodos são utilizados principalmente por biólogos para produzir imagens de células para fins qualitativos: o monitoramento da morfologia, rastreamento de estruturas subcelulares e investigações de dinâmica da membrana ^9. Estas técnicas são qualitativa na sua configuração de "off-the-shelf" tanto como fase e DIImagens c são funções arbitrárias da intensidade da fonte de luz, as configurações óptica iluminação, e ganho da câmera CCD, gama e configurações de exposição.

Uma pequena legião de físicos e engenheiros ópticos tem se esforçado para fazer exames de imagem comerciais quantitativa. Entre os primeiros esforços foram duas cartas à natureza em 1952 e 1953, em que o médico que virou biofísico Robert Barer demonstrado o uso de microscopia de fase para determinar a massa seca celular das células estimando mudanças de fase através destes tipos de células utilizando um microscópio de fase disponível comercialmente ^{10, 11.} O campo tem desenvolvido uma infinidade de técnicas ao longo dos anos seguintes com base em torno de três mecanismos básicos de contraste sem rótulo: microscopia de fase ^10,11, microscopia DIC ^{12-17, 18-22} e brilhante campo para determinar óptico caminho de comprimento, fase em massa densidade, índice de refração, e volume celular.

No Parállel, uma grande coleção de instrumentos ópticos personalizados também têm sido desenvolvidos desde os anos 1950, e fizeram de longo alcance medições ópticas que vão desde aplicações em crescimento do parasita ^23, para documentar o ciclo celular ²⁴ para investigar a dinâmica da membrana das células vermelhas do sangue ^25. Em particular, nos últimos dez anos tem visto uma riqueza de microscopia quantitativa sem rótulo na forma de microscopia de fase difração de ^26, microscopia tomográfica fase ^27, microscopia holográfica digital ^28, sensível microscopia de coerência óptica fase ^29, microscopia de interferência de luz espacial ^30, Hilbert fase microscopia ^31, e microscopia de fase quantitativa ^32. Apesar de seus sucessos coletivos, estes instrumentos não tenham sido divulgadas ao maior campo de pesquisadores biológicos, devido, principalmente, à sua instrumentação complexa e requisitos computacionais.

Aqui nós describe o uso de um microscópio óptico padrão para realizar medidas quantitativas de massa, volume e densidade em amostras celulares através de uma combinação de campo claro e imagens DIC. Duas abordagens principais são apresentados: microscopia de fase quantitativa noninterferometric (NIQPM), para realizar medições de massa total de células e distribuição da densidade subcelular, e Hilbert transformar microscopia de contraste de interferência diferencial (HTDIC), para determinar o volume. As principais vantagens do NIQPM e HTDIC estava em sua acessibilidade tecnológica. As condições de imagem necessários para a sua realização bem sucedida estão dentro do âmbito do funcionamento normal da maioria dos microscópios disponíveis comercialmente. Além disso, os algoritmos de pós-processamento são estáveis, rápido e robusto – tendo sido implementado em MATLAB usando transformada de Fourier rápida algoritmos (FFT) com base, sempre que possível.

NIQPM é um método para reconstruir fase e a densidade de massa integrada axialmente de celespécimes intracelular de imagens de campo claro. Soma desta densidade de massa integrada axialmente ao longo da área da amostra dá o teor de matéria seca total da amostra. O protocolo NIQPM baseia-se nas bases experimentais definidas por Paganin Nugent e ^{18, 19} – em que foi demonstrado que o perfil de fase de uma célula pode ser reconstruído a partir das imagens da amostra através do foco de campo brilhante – e o trabalho teórico de Frank , Altmeyer e Wernicke ²⁰ – na resolução dos modelos de ondas paraxiais de forma eficiente com base em FFT. A ligação da fase com a densidade de massa seca é baseado no trabalho por Barer ^{10, 11} e Popescu ^33.

Informações volumétrica podem ser obtidas a partir de imagens por meio de DIC-focagem sob condições de iluminação elevados de NA que permitem o corte óptico da amostra ao longo do eixo óptico. Hilbert transformar processamento nas pilhas de imagens DIC aumenta muitoalgoritmos de detecção de borda para a localização das fronteiras de amostras em três dimensões, separando os valores de cinzento da intensidade espécime das do fundo. Isto origina trabalho com Arinson et al. Embora ³⁴ foram introduzidos os dois métodos de filtragem de Fourier para aumentar o contraste e um método de detecção de borda à base de Sobel para análise volumétrica automatizada de amostra. Temos também validado HTDIC anteriormente em esferas de poliestireno que variam em tamanho desde o limite de difração de até 20 m de diâmetro ^36.

Embora ambos NIQPM e HTDIC são tecnologicamente acessíveis devido ao seu desenvolvimento em microscópios comerciais, os métodos são fundamentalmente limitada pela configuração das próprias microscópios de hardware. As limitações primárias de estas técnicas são duas vertentes: z-stack tempo de aquisição lenta em âmbitos comerciais, devido à tradução de todo o estágio da amostra ao invés de apenas a lente objetiva, Limita actualmente a investigação de fenómenos mais rápidos do que cerca de um quadro / minuto, e, por outro, os efeitos de difracção de restringir a utilidade de NIQPM e HTDIC para objectos que variam em tamanho desde 0,2 até 10 e 20 um de diâmetro, respectivamente. Assim, a amostra e sua dinâmica de tempo associados de interesse deve atender determinado tamanho e restrições temporais para permitir a utilização destes métodos em instrumentos típicos "off-the-shelf". Empolgante, a maioria das amostras celulares fixos são prontamente investigadas com estes métodos.

Uma visão geral do NIQPM e protocolos HTDIC são apresentados na Figura 1. Na Figura 2 ilustramos imagem ideal e de qualidade inferior por meio de foco em condições de baixa e alta iluminação NA tanto para campo claro e imagens DIC. Figuras 3 e 4 demonstram a dependência de parâmetros do algoritmo NIQPM destacando implementações bem sucedidas e mal sucedidas. <strong> A Figura 5 ilustra os passos envolvidos no algoritmo de processamento de imagem HTDIC e demonstra a aplicação óptima do algoritmo para determinar o volume celular.

Protocol

1. Microscópio Especificações Para a realização de imagens na forma correta o microscópio deve ter as seguintes especificações: Possuir tanto contraste de interferência diferencial (DIC) e de campo claro (BF) de contraste. Já movimento do eixo z controlados por computador. Possui uma paragem de abertura ajustável para variar a abertura numérica da lente de condensador. Uma abertura com uma regra graduada ou leitura eletrônica é necessária para sa…

Representative Results

Iluminação amostra correta durante a aquisição de imagem através de foco é fundamental para o sucesso da implementação do NIQPM um ​​nd algoritmos HTDIC. Na Figura 2 ilustramos baixa e alta iluminação NA sob tanto DIC e brilhante contraste campo para uma esfera de poliestireno ea linha de células de adenocarcinoma colorretal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I e 2K demonstrar imagem ideal para NIQPM. Figuras 2F, 2H, 2N, e 2P…

Discussion

Em geral, NIQPM é uma técnica de difração limitada validado no caminho comprimentos ópticos que vão ,25-44,7. Validação foi realizada em n = 1,596 esferas de poliestireno que variam em diâmetro 0,11-9,8 mM suspenso em Fluoromount G (dados não mostrados). As células possuem comprimentos de caminho óptico que variam de cerca de 0-7.

Ao medir a distribuição da densidade de uma amostra pode-se achar que a imagem do pseudo DIC parece bem, enquanto o mapa de densidade possui indeseja…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media