Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Se describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo brillante y contraste de interferencia diferencial imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y distribución de la densidad subcelular, y transformada de Hilbert diferencial microscopía de contraste de interferencia (HTDIC) para determinar el volumen. NIQPM se basa en un modelo simplificado de la propagación de ondas, llamadas a la aproximación paraxial, con tres supuestos básicos: apertura numérica baja (NA) de iluminación, dispersión débil y débil absorción de la luz por la muestra. Afortunadamente, muestras celulares sin teñir satisfacen estos supuestos y bajo iluminación NA se consigue fácilmente en microscopios comerciales. HTDIC se utiliza para obtener información volumétrica de DIC imágenes a través de enfoque a alta Illumin NAcondiciones ación. Iluminación de alta NA permite mejorada de seccionamiento de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen DIC apila en gran medida mejora algoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica utilizando microscopios "off-the-shelf". Hay dos limitaciones básicas de estos métodos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales actualmente abroga la investigación de los fenómenos más rápido que 1 cuadro / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos desde el 0,2 hasta el 10 (NIQPM) y 20 (HTDIC) micras de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, las muestras y su tiempo asociado dinámica de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos. Emocionante, cellula más fijoespecímenes r son investigados fácilmente con estos métodos.

Introduction

El uso de microscopía óptica es ahora omnipresente en la investigación de organismos celulares. Debido a su absorbancia y dispersión débil propiedades endógenas bajo sobre el espectro óptico visible, las células no afectan en gran medida la amplitud de las ondas ópticas que atraviesan ellos y por lo tanto aparecen semitransparente cuando reflejado con microscopios de campo brillante estándar. Muestras celulares no, sin embargo, reducir la velocidad ondas ópticas que viajan a través de ellos de una manera que está relacionada linealmente con la cantidad de densidad de masa local en una región particular del espacio a través del cual la luz viaja. La utilización de este lapso de tiempo heterogéneo o perfil "fase" de las ondas ópticas transmitidas a través de las muestras microscópicas fue descrita por primera vez en 1935 por Frits Zernike ¹ y experimentalmente se dio cuenta por Zernikein 1942 ^2. Zernike fue galardonado con el premio Nobel en 1953 por este logro. Zeiss comercializó esta modalidad en 1945 ^3. En 1955, Smith y Nomarskme volvería a presentar su trabajo inicial sobre el uso ^{de 4} y ⁵ de la teoría de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía, una modalidad que utiliza el gradiente espacial de fase como un mecanismo de contraste. DIC fue comercializado por Zeiss en 1965in estrecha colaboración con Nomarski ^6. En 1981, dos laboratorios demostraron la primera célula viva DIC imágenes grabadas con la incorporación de cámaras de vídeo en el tren de la óptica del microscopio DIC ^{7, 8.} La era de imágenes de células vivas nació.

Desde este momento, la ejecución de tanto de contraste de fases y DIC en microscopios comerciales ha sido en gran parte sin cambios. Estos métodos se utilizan principalmente por los biólogos para producir imágenes de las células para los propósitos cualitativos: monitorización de la morfología, el seguimiento de las estructuras subcelulares, y las investigaciones de dinámica de la membrana ^9. Estas técnicas son de carácter cualitativo en su configuración "off-the-shelf" ya que tanto la fase y DIImágenes C son funciones arbitrarias de la intensidad de la fuente de luz, la configuración óptica de iluminación, y ganancia de la cámara CCD, gamma y los ajustes de exposición.

Una pequeña legión de físicos e ingenieros ópticos se ha esforzado por hacer que las modalidades de imágenes comerciales cuantitativa. Entre los primeros esfuerzos fueron dos cartas a la Naturaleza en 1952 y 1953 en los que el médico-biofísico convertido Robert Barer demostrado el uso de la microscopía de fase para determinar la masa seca celular de las células mediante la estimación de los cambios de fase a través de estos tipos de células usando un microscopio de fase disponible en el mercado ^{10, 11.} El campo se ha desarrollado una multitud de técnicas en los años siguientes con base en torno a tres mecanismos de contraste sin etiquetas básicas: microscopía de fase ^10,11, DIC microscopía ^{12-17, 18-22} y luminosa de campo para determinar la longitud del recorrido óptico, la fase, la masa densidad, índice de refracción, y el volumen celular.

En el párrafollel, una gran colección de instrumentos ópticos personalizados también se han desarrollado desde la década de 1950, y han hecho de gran alcance mediciones ópticas que van desde aplicaciones en el crecimiento del parásito ^23, a documentar el ciclo celular ²⁴ a la investigación de la dinámica de la membrana de las células rojas de la sangre ^25. En particular, los últimos diez años se ha producido una gran cantidad de microscopía cuantitativa libre de marca en forma de microscopía de fase de difracción ^26, microscopia tomográfica fase ^27, la microscopia holográfica digital ^28, sensible a la fase de microscopía de coherencia óptica ^29, la microscopía de interferencia espacial de luz ^30, Hilbert fase de la microscopía ^{de 31 años,} y la microscopía de fase cuantitativa ^32. A pesar de sus éxitos colectivos, estos instrumentos no han sido difundidos en el campo más amplio de investigadores biológicos, debido, sobre todo, a su compleja instrumentación y requerimientos computacionales.

Aquí nos describe el uso de un microscopio óptico estándar para llevar a cabo las mediciones cuantitativas de la masa, volumen y densidad en muestras celulares a través de una combinación de campo claro y DIC imágenes. Se presentan dos enfoques principales: la microscopía de fase cuantitativa noninterferometric (NIQPM), para llevar a cabo mediciones de la masa celular total y la distribución de la densidad subcelular, y la transformada de Hilbert microscopía de contraste diferencial de interferencia (HTDIC), para determinar el volumen. Las principales ventajas de NIQPM y HTDIC yacían en su accesibilidad tecnológica. Las condiciones de formación de imágenes requeridas para su ejecución exitosa están dentro del alcance de la operación normal de la mayoría de los microscopios disponibles comercialmente. Además, los algoritmos de procesamiento posterior son estables, rápida y robusta – habiendo sido implementado en MATLAB utilizando algoritmos de transformada rápida de Fourier (FFT) basadas siempre que sea posible.

NIQPM es un método para reconstruir de fase y la densidad de masa integrado axialmente de CELespecímenes lular de brillante imaginería campo. La suma de esta densidad de masa integrado axialmente sobre el área de la muestra da el contenido en masa seca total de la muestra. El protocolo NIQPM se basa en los fundamentos experimentales establecidas por Paganin y Nugent ^{18, 19} – en el que se demostró que el perfil de fase de una célula podría ser reconstruido a partir través de enfoque de campo brillante imágenes de la muestra – y el trabajo teórico de Frank , Altmeyer, y de Wernicke ²⁰ – en la resolución de los modelos de onda paraxial de una manera eficiente basado en FFT. La conexión de fase a la densidad de masa seca se basa en el trabajo por Barer ^{10, 11} y Popescu ^33.

Información volumétrica se puede obtener de a través de enfoque DIC imágenes bajo altas condiciones de iluminación NA que permiten seccionamiento óptico de la muestra a lo largo del eje óptico. Transformada de Hilbert de procesamiento en la imagen pilas DIC mejora muchoalgoritmos de detección de bordes para la localización de las fronteras de muestras en tres dimensiones mediante la separación de los valores de gris de la intensidad de la muestra de las del fondo. Este trabajo se origina con Arinson et al. ³⁴ aunque hemos introducido los dos métodos de filtrado de Fourier para mejorar el contraste y un método de detección de borde a base de Sobel para el análisis automatizado volumétrica de la muestra. También hemos validado HTDIC anteriormente en esferas de poliestireno que varían en tamaño desde el límite de difracción de hasta 20 m de diámetro ^36.

Mientras tanto NIQPM y HTDIC son tecnológicamente accesible debido a su desarrollo en microscopios comerciales, los métodos son fundamentalmente limitadas por la configuración de hardware de los propios microscopios. Las principales limitaciones de estas técnicas son de dos tipos: z-stack tiempo de adquisición lento en ámbitos comerciales, debido a la traducción de toda la etapa de la muestra en lugar de sólo la lente del objetivo, Limita la investigación de los fenómenos más rápido que más o menos 1 marco / minuto, y en segundo lugar, los efectos de difracción restringen la utilidad de NIQPM y HTDIC a los objetos que van en tamaño desde 0,2 hasta 10 y 20 m de diámetro, respectivamente. Por lo tanto, la muestra y su dinámica de tiempo asociados de interés deben cumplir con cierto tamaño y restricciones temporales para permitir el uso de estos métodos en los instrumentos típicos "off-the-shelf". Emocionantemente, la mayoría de los especímenes celulares fijos son investigados fácilmente con estos métodos.

Una visión general del NIQPM y protocolos HTDIC se dan en la Figura 1. En la figura 2 se ilustra la imagen óptima y subóptima a través de enfoque en condiciones tanto de baja y alta iluminación NA, tanto para campo claro y DIC imágenes. Las figuras 3 y 4 muestran la dependencia de parámetros del algoritmo NIQPM destacando implementaciones exitosas y no exitosas. <strong> Figura 5 ilustra los pasos involucrados en el algoritmo de procesamiento de imágenes HTDIC y demuestra la óptima implementación del algoritmo para determinar el volumen celular.

Protocol

1. Microscopio Especificaciones Para llevar a cabo las imágenes de la manera correcta el microscopio debe tener las siguientes especificaciones: Poseer tanto contraste de interferencia diferencial (DIC) y campo claro (BF) de contraste. Tener movimiento según el eje Z controlado por ordenador. Tener un tope de apertura ajustable para variar la apertura numérica de la lente de condensador. Se requiere una abertura con una regla graduada o de lectura electróni…

Representative Results

Iluminación de la muestra correcta durante la adquisición de imágenes a través de enfoque es fundamental para la implementación exitosa de la NIQPM A ND algoritmos HTDIC. En la Figura 2 se ilustra de baja y alta iluminación NA bajo tanto DIC y contraste de campo claro para una esfera de poliestireno y la línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano SW620. Figuras 2A, 2C, 2I, y 2K demuestran de formación de imágenes óptima para NIQPM. <st…

Discussion

En general, NIQPM es una técnica de difracción limitada validado en longitudes de trayectoria óptica que van desde 0,25 hasta 44,7. La validación se realizó en n = 1.596 esferas de poliestireno que varían en diámetro desde 0,11 hasta 9,8 micras en suspensión en Fluoromount G (datos no mostrados). Las células poseen longitudes de trayectoria óptica que van desde casi 0-7.

Cuando se mide la distribución de la densidad de una muestra se puede encontrar que la imagen DIC seudo ve bien…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media