Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri
Summary
We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.
Abstract
Bu, parlak alan ve diferansiyel girişim kontrast görüntüleri bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun sayısal ölçümler için standart bir optik mikroskop kullanılmasını tarif eder. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. Düşük sayısal açıklık (NA) aydınlatma, zayıf saçılma ve numune tarafından ışığın zayıf emilimi: NIQPM dalga yayılımının basitleştirilmiş bir modeline dayanan, üç temel varsayımlar ile, paraksiyel yaklaşım olarak adlandırılır. Neyse ki, boyanmamış hücre örnekleri bu varsayımları karşılamak ve düşük NA aydınlatma kolayca ticari mikroskopları üzerinde elde edilir. HTDIC yüksek NA aydinlatma altında odak-boyunca DIC görüntüleri hacimsel bilgileri elde etmek için kullanılıration koşulları. Yüksek aydınlatma NA optik eksen boyunca numunenin geliştirilmiş bölümlendirilmeleri sağlar. Hilbert DIC görüntü işleme dönüşümü büyük ölçüde yığınlarının arka olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları artırır. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları "off-the-raf" mikroskop kullanarak teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Ticari kapsamları yavaş z-yığını alma zamanı henüz hızlı 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma lağvetti, ve ikincisi, kırınım etkileri 10'a kadar 0.2 ila nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak: Bu yöntemlerin iki temel sınırlamaları vardır sırasıyla (NIQPM) ve çapı 20 (HTDIC) um. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, çoğu sabit cellular örnekler hali hazırda, bu yöntemler ile incelenmiştir.
Introduction
Optik mikroskop kullanımı artık hücresel organizmaların araştırılmasında her yerde. Nedeniyle görünür optik spektrum üzerinde düşük endojen absorbans ve zayıf saçılma özellikleri, hücreler güçlü onları geçme optik dalgaların genlik etkileyebilir ve böylece standart parlak alan mikroskopları ile görüntülenmiş zaman yarı saydam görünmüyor. Hücresel örnekleri, bununla birlikte, doğrusal ışık hareket ettiği alanı belirli bir bölgede yerel bir kütle yoğunluğunun miktarı ile ilgili bir şekilde, kendi içinde seyahat eden optik dalgalar aşağı yavaş yok. Bu heterojen gecikmeyle veya mikroskobik yoluyla bulaşan optik dalgaların "faz" profilinin yararlanması ilk Fritleri Zernike 1 tarafından 1935 yılında tarif edilen ve deneysel Zernikein 1942 2 tarafından gerçekleştirilmiştir. Zernike bu başarı için 1953 yılında Nobel ödülü aldı. Zeiss 1945 3 bu yöntemi ticari. 1955 yılında Smith ve Nomarski diferansiyel girişim kontrast (DIC) mikroskopi, bir kontrast mekanizması olarak faz uzaysal gradyanı kullanan bir yöntem kullanımıyla 4 ve 5 teorisi üzerindeki ilk çalışma mevcut olacaktır. DIC Nomarski 6 ile 1965in yakın işbirliği içinde Zeiss tarafından ticari oldu. 1981 yılında, iki laboratuvar DIC mikroskop 7, 8 optik trenin içine video kameralar eklenmesi ile kaydedilmiş ilk canlı hücre DIC görüntüleri gösterdi. Canlı hücre görüntüleme çağı doğdu.
O tarihten bu yana, ticari mikroskoplar üzerinde faz kontrast ve DIC hem yürütme büyük ölçüde değişmeden olmuştur. Morfolojisi, hücre altı yapıların takibi, ve membran dinamikleri 9 soruşturmalarının izlenmesi: Bu yöntemler esas nitel amaçlar için hücrelerin görüntülerini üretmek için biyologlar tarafından kullanılmaktadır. Bu teknikler faz ve dı olarak "off-the-raf" konfigürasyonunda nitelC görüntüleri keyfi ışık kaynağı yoğunluğu fonksiyonları, aydınlatma optik ayarları ve CCD kamera kazanç, gama ve pozlama ayarları vardır.
Fizikçiler ve optik mühendisleri küçük bir lejyon ticari görüntüleme yöntemleri nicel yapmak için çaba harcadı. İlk çabaları arasında hekim-açık-Biyofizikçi Robert Barer piyasada bulunan bir fazlı mikroskop kullanarak bu hücre türleri ile faz değişimleri tahmin ederek hücrelerin hücre kuru kütlesini belirlemek için faz mikroskobu kullanımı gösterilmiş olan 1952 ve 1953 yılında Nature iki mektup vardı 10, 11. Faz mikroskopi 10,11, DIC mikroskopi 12-17, ve optik yol uzunluğu, faz, kütlesini belirlemek için parlak bir alan 18-22: alan üç temel etiket ücretsiz kontrast mekanizmaları etrafında dayalı takip eden yılda teknikleri çok sayıda geliştirdi yoğunluk, kırılma indeksi ve hücre hacmi.
Paragraftallel, özel optik araçlar geniş bir koleksiyon da 1950'lerden beri geliştirilmiştir ve parazit büyüme 23 uygulamalar, kırmızı kan hücrelerinin 25 membran dinamikleri soruşturma hücre döngüsünü 24 belgeleyen değişen optik ölçümler geniş kapsamlı yaptık. Özellikle, son on yıl kırınım faz mikroskobu 26 şeklinde, tomografik faz mikroskopi 27, dijital holografik mikroskopi 28, faz duyarlı optik koherens mikroskopi 29, uzaysal ışık girişim mikroskopisi 30, Hilbert etiket içermeyen nicel mikroskopi bir zenginlik gördü faz mikroskopi 31, ve kantitatif faz mikroskopi 32. Toplu başarılara rağmen, bu araçlar onların karmaşık enstrümantasyon ve hesaplama gereksinimleri, çoğunlukla nedeniyle biyolojik araştırmacıların büyük alana saçılmış olmamıştır.
Burada biz dAydınlık saha ve DIC görüntülerinin bir kombinasyonu yoluyla kütle, hacim, ve hücre örneklerinde yoğunluğunun niceliksel ölçümlerini gerçekleştirmek için bir optik mikroskop kullanımını escribe. Iki ana yaklaşım sunulmaktadır: noninterferometric kantitatif faz mikroskobu (NIQPM), toplam hücre kütlesi ve subselüler yoğunluğu dağılımı ölçümleri gerçekleştirmek için, ve Hilbert hacmini belirlemek için, diferansiyel girişim kontrast mikroskobu (HTDIC) dönüşümü. NIQPM ve HTDIC birincil avantajları teknolojik erişilebilirlik yatıyordu. Başarılı yürütülmesi için gerekli olan görüntüleme koşulları en ticari olarak temin edilebilir mikroskoplar normal çalışma kapsamı içindedir. Ayrıca, post-işleme algoritmaları, istikrarlı, hızlı ve sağlam – mümkün hızlı Fourier (FFT) tabanlı algoritmaları dönüşümü kullanılarak MATLAB uygulanmakta olan.
NIQPM faz ve cel, eksensel olarak entegre kütle yoğunluğu oluşturmak için bir yöntemdirparlak bir alan görüntülerinden lular örnekleri. Numunenin bu alan üzerinde eksensel olarak entegre kütle yoğunluğunun toplamı numunenin toplam kuru kütle içeriği verir. Bir hücrenin faz profili numunenin odak-boyunca parlak bir alan görüntülerinin yeniden inşa edilebileceği gösterilmiştir edildiği – – NIQPM protokol Paganin ve Nugent 18, 19 döşediği deneysel temellere dayanmakta ve Frank teorik çalışma , Altmeyer ve Wernicke 20 – verimli bir FFT-tabanlı şekilde paraksiyel dalga modellerini çözme. Kuru kütle yoğunluğuna fazın bağlantı Barer 10, 11 ve 33 ile Popescu çalışma üzerine dayanır.
Hacimsel bilgiler optik eksen boyunca numunenin optik olarak kısımlara sağlayan yüksek NA aydınlatma koşulları altında odak-boyunca DIC görüntü elde edilebilir. Hilbert DIC görüntü yığınlarının üzerinde işlem dönüşümü büyük ölçüde artırırArka plan olanlardan numune yoğunluğu gri değerleri ayırarak üç boyutlu olarak numune sınırların lokalizasyonu için kenar algılama algoritmaları. Bu kontrast ve numunenin otomatik analizi için bir hacimsel sobel dayalı kenar algılama yöntemi geliştirmek için her iki Fourier filtreleme sebep olacak, ancak bu çalışma Arinson et al. 34 ile kaynaklanmaktadır. Biz de kırınım sınırından yukarı çapı 36, 20 mikron boyutu arasında değişen polistiren küreler daha önce HTDIC geçerliliği var.
NIQPM ve HTDIC hem ticari mikroskopları onların gelişimine nedeniyle teknolojik erişilebilir olmakla birlikte, yöntemler temelde mikroskopları kendilerini donanım konfigürasyonu ile sınırlıdır. Bu tekniklerin temel sınırlamalar iki kat vardır: aksine nedeniyle tüm numune aşamasında çeviri, ticari Kabinlerdekilerden yavaş z-yığını alma zamanı sadece objektif lens içinŞu anda hızlı kabaca 1 kare / dakikadan daha olayların soruşturma sınırlar, ve ikincisi, kırınım etkileri sırasıyla, çapı 10 ve 20 mikron kadar 0.2 arasında değişen büyüklüklerde nesnelere NIQPM ve HTDIC yarar kısıtlamak. Bu nedenle, ilgi numune ve ilişkili zaman dinamikleri tipik "off-the-raf" enstrümanlar üzerinde bu yöntemlerin kullanımını etkinleştirmek için belirli bir büyüklüğe ve zamansal kısıtlamaları karşılamak gerekir. Heyecan verici, en sabit hücresel örnekleri kolayca bu yöntemler ile incelenmiştir.
NIQPM ve HTDIC protokollerin bir genel görünüşü Şekil 1'de verilmiştir. Şekil 2 biz, parlak alan ve DIC görüntüleri hem düşük hem de yüksek NA aydınlatma koşulları altında optimal ve optimal yoluyla odak görüntüleme göstermektedir. 3 ve 4 başarılı ve başarısız uygulamaları vurgulayarak NIQPM algoritmasının parametre bağımlılığını göstermektedir Rakamlar. <strong> Şekil 5, HTDIC görüntü işleme algoritması dahil adımları göstermektedir ve hücre hacmini belirlemek için algoritmanın en uygun uygulama göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genel olarak, NIQPM ,25-44,7 değişen optik yol uzunlukları üzerinde doğrulanmış bir kırınım-sınırlı bir tekniktir. Doğrulama n gerçekleştirilmiştir = Fluoromount G içinde süspansiyon haline 0.11-9.8 um çap arasında değişen 1,596 polistiren küreler (veriler gösterilmemiştir). Hücreler yaklaşık 0-7 aralığında optik yol uzunluklarına sahip.
Bir numunenin yoğunluk dağılımını ölçerken bir yoğunluk haritası, arka plandaki istenmeyen katkıları sahip iken…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (OJTM için KGP, OJTM ve R01HL101972 için U54CA143906) ve Oregon Tıbbi Araştırma Vakfı Erken Klinik Araştırmacı Ödülü (KGP) hibe tarafından desteklenmiştir. OJTM bir Amerikan Kalp Derneği Kuruldu Araştırmacı (13EIA12630000) 'dir. Biz bu çalışmada kullanılan hücre örnekleri hazırlamak için Şövalye Kanser Enstitüsü'nden Dr Eric Anderson teşekkür ederim.
Materials
| Zeiss Axio Imager 2 microscope | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany | Axio Imager D2 | Microscope |
| Green filter (λ = 540 ± 25 nm) | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont | D540/25x | Green filter |
| SlideBook 5.5 software | Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado | Image acquistion software | |
| Polystyrene microspheres | Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN | PS06N | Polystyrene spheres |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama | 0100-01 | Mounting media |
Riferimenti
- Zernike, F. Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung. Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).
- Zernike, F. Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects. Physica. 9 (42), 974-986 (1942).
- Blow, N. Finding Phase. Nat. Cell Biol. 11, (2009).
- Smith, F. H. . Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).
- Nomarski, G. Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées. J. Phys. Radium. 16, (1955).
- Lang, W. Nomarski differential-interference contrast microscopy. Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).
- Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris. Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).
- Inoué, S. Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy. J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).
- Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. Platelet shape change and spreading. Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).
- Barer, R. Interference microscopy and mass determination. Nature. 169, 366-367 (1038).
- Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, Refractometry of living cells. Nature. 171, 720-724 (1953).
- Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy. J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).
- Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy. J. Microsc. 214, 7-12 (2004).
- Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope. J. Microsc. 188, 149-157 (1997).
- Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging. Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).
- Xu, M. Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media. Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).
- Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude. J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).
- Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. Quantitative optical phase microscopy. Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).
- Paganin, D., Nugent, K. A. Non-interferometric phase imaging with partially coherent light. Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).
- Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. o. n. -. i. n. t. e. r. f. e. r. o. m. e. t. r. i. c. non-iterative phase retrieval by Green’s functions. J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).
- Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient. Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).
- Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope. Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).
- Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum. , 105-13730 (2008).
- Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).
- Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. Optical measurement of cell membrane tension. Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).
- Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics. Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).
- Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. Tomographic phase microscopy. Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy. Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).
- Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging. Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).
- Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. Spatial light interference microscopy. SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).
- Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems. Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).
- Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics. Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).
- Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).
- Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images. J. Microsc. 199, 79-84 (2001).
- Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation. Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).
