Neuroblast migration är ett avgörande steg i postnatal neurogenes. Protokollet som beskrivs här kan användas för att undersöka rollen av kandidat regulatorer av neuroblast migration genom användning av DNA / liten hårnål RNA (shRNA) nucleofection och en 3D-migration assay med neuroblaster som isolerats från gnagare postnatal rostral migratory stream.
Den subventrikulära zonen (SVZ) belägen i sidoväggen av de laterala ventriklarna spelar en grundläggande roll i vuxen neurogenes. I detta begränsade område i hjärnan, neurala stamceller föröka sig och ständigt genererar neuroblaster som flyttar tangentiellt i kedjor längs rostralt vandrande ström (RMS) för att nå luktbulben (OB). En gång i OB, neuroblaster byta till radiell migration och differentiera till mogna nervceller som kan införliva i den redan existerande neuronala nätverk. Korrekt migration neuroblast är ett grundläggande steg i neurogenesis, säkerställa en korrekt funktionell mognad av nyfödda nervceller. Med tanke på möjligheten av SVZ-härledda neuroblaster att rikta skadade områden i hjärnan, undersöker de intracellulära mekanismerna bakom deras rörlighet kommer inte bara att öka förståelsen av neurogenes, men kan också främja utvecklingen av neuroregenerative strategier.
Detta manuskript beskriver en detaljeradprotokoll för transfektion av primära gnagare RMS postnatal neuroblaster och analysen av deras rörlighet med hjälp av en 3D-vitro migrationstest på rekapitulera sitt läge migration observerats in vivo. Både rått-och mus-neuroblaster kan vara snabbt och effektivt transfekterats via nucleofection med antingen plasmid-DNA, liten hårnål (sh) RNA eller kort interfererande (si) RNA oligos targeting gener av intresse. För att analysera migration, är nucleofected celler reaggregated i "hängande droppar" och sedan inbäddade i en tredimensionell matris. Nucleofection i sig inte väsentligt försämrar migration av neuroblaster. Farmakologisk behandling av nucleofected och reaggregated neuroblaster kan också göras för att studera betydelsen av signalvägar som är involverade i neuroblast migration.
I den postnatal däggdjurshjärnan, generering av nya nervceller (neurogenes) sker under hela livet och är begränsad till två neurogena nischer: subventrikulära zonen (SVZ) av de laterala ventriklarna och subgranular zonen i gyrus dentatus i hippocampus 1. Flera nya studier har visat den viktiga roll som vuxen neurogenes underlätta inlärning och minnesuppgifter 2,3. Vidare bevis för spridning och rekrytering av neurala stamceller efter hjärnskada 4-7 behandlas möjligheten att farmakologisk aktivering av neurogenes i neurala reparation.
Postnatal neurogenes är strikt reglerad i alla dess faser, som inkluderar neurala progenitorceller proliferation, migration, differentiering, överlevnad, och sista synaptisk integration av nyfödda nervceller 8. Neurala stamceller (neuroblaster) härrör från stamceller i SVZ vandrar över långa sträckor genom den rostrala migrationsström (RMS) mot luktbulben (OB) där de mogna till funktionella nervceller 9. Flyttneuroblaster är övervägande unipolär, med en långsträckt cellkroppen sträcker sig en enda ledande process. Dessa celler rör sig i kedjor i ett kollektivt sätt, glider över varandra 10. Migration är ett avgörande steg för den efterföljande mognaden av SVZ-härledda stamfäder till fungerande nervceller 11 och styrs av flera faktorer och väglednings molekyler inklusive: polysialylated neural celladhesionsmolekyl (PSA-NCAM) 12, Ephrins 13, integriner 14, Slits 15, tillväxtfaktorer 16 och neurotransmittorer 17 emellertid de molekylära mekanismerna bakom denna process är inte helt klarlagda. Undersöka de intracellulära signalvägar som reglerar neuroblast migration kommer inte bara att ge en bättre förståelse av den vuxna neurogenes, men kommer också att bidra till utvecklingen av nya terapeutiskatillvägagångssätt för att främja hjärnans reparation.
Detta manuskript beskriver ett detaljerat protokoll för att studera rollen av kandidat regulatorer av neuroblast migration in vitro med hjälp nucleofection och en 3D-analys migration. Nucleofection är en cell transfektion teknik baserad på ett förbättrat förfarande för elektroporering. Cell-typ specifik elektrisk ström och nucleofection lösning möjliggör överföring av polyanjoniska makromolekyler såsom DNA och shRNA vektorer och siRNA oligonukleotider direkt in i cellkärnan och tillstånds transfektion av långsamt dela eller mitotiskt inaktiva celler som foster-och däggdjurs nervceller 18. Denna metod är snabb, relativt enkelt att utföra och resulterar i mycket reproducerbar transfektion av ett brett spektrum av celltyper inklusive primära neuroblaster och neuroner 19-21.
Dissociation av RMS-vävnad möjliggör isolering av flyttande neuroblaster, som framgångsrikt kan nucleofected med DNA / SHRNA-vektorer eller siRNA oligos riktar gener av intresse. Efter nucleofection är neuroblaster reaggregated i hängande droppar och därefter bäddas in i en tredimensionell Matrigel matris. Dessa förhållanden gör att neuroblaster att migrera ut ur cellaggregat rekapitulera migrationsläget observerats in vivo, vilket ger ett utmärkt modellsystem för att undersöka signalvägar involverade i neuroblast migration och för att bedöma inverkan av farmakologisk behandling på motilitet av dessa celler.
Migrationen av neuroblaster längs RMS till den slutliga placeringen i OB är ett grundläggande steg i postnatal neurogenes. Men de molekylära mekanismer som styr denna komplicerade process är långt ifrån helt klarlagda.
Det experimentella förfarandet beskrivs här tillåter studiet av neuroblast migration in vitro. Vi har anpassat ett tidigare publicerat protokoll för att isolera RMS neuroblaster från tidig postnatal mus eller råtta 25. För att uppnå optimala resultat är det viktigt att behärska dissektion steg, eftersom det är viktigt att hålla den tid som förflyter mellan dissekering och nucleofection till ett minimum. Efter nucleofection kan neuroblaster vara reaggregated, inbäddade i en tre-dimensionell matris och lämnades att migrera över en 24 h period. Alternativt, för andra än migration (t.ex. immunofluorescens eller Western blot-analys) ändamål, celler kan direkt klädd efter nucleofection på polyornithine/laminin-belagda täckglas, där de överlever upp till 4-5 dagar. Mus och råtta neuroblaster vandrar i Matrigel i liknande utsträckning, men musceller verkar ha en starkare tendens att migrera i kedjor än råttceller.
Beroende på syftet med studien, kan neuroblaster vara nucleofected med olika plasmider som kodar för fluorescerande proteiner eller vildtyp / mutant proteiner av intresse. För optimala protein uttryckningsplasmider med CAG promotor (β-aktin promotor med CMV-förstärkare och β-globin poly-A svans) 26 rekommenderas starkt. Dessutom kan siRNA oligos eller shRNA plasmider nucleofected att knockdown mål av intresse. Effektiv protein utarmning kan visualiseras genom immunofluorescens eller genom western blöt (vanligtvis lyse inbäddade aggregat från en råttunge med 50 ul av standard lysbuffert).
Nucleofection är en relativt enkel metod för att transfektera primära neuroblaster, och erbjuder en enklare och snabbare alternativ till VIral vektor-medierad transfektion, och kan uppnå hög (~ 70-80%) transfektionseffektivitet. Det är viktigt att arbeta snabbt under nucleofection förfarandet, efter att ha lämnat neuroblaster i nucleofection lösningen under en längre tid drastiskt minskar cellernas livskraft.
Den genomsnittliga cellutbyte från RMS dissektion är relativt låg för P7-möss (~ 5 x 10 5 celler / hjärna) i jämförelse med P7-råttor (~ 1 x 10 6 celler / hjärna) och minst 3 x 10 6 celler per nucleofection krävs för att uppnå transfektion med ~ 50% effektivitet. Dessutom råttneuroblaster verkar motstå bättre att Nucleofection jämfört med mus-neuroblaster. Därför kan tidig födsel (P6-P7) råttungar utgör en bekväm neuroblast källa, även med tanke på att organisationen av råtta och mus RMS är påfallande liklar 27 och att omfattningen av rått-och mus-neuroblast migration in vitro är också jämförbara. Det rekommenderas inte att hålla reaggregated kluster av nucleofected neuroblaster i suspension under längre tid än 48 timmar för att undvika onormala effekter på cell morfologi och migration (våra opublicerade observationer).
3D-analys som beskrivs här kan användas för att kvantifiera neuroblast migration vid en fixerad tidpunkt efter inbäddning i matrix (t.ex.. 24 h). Aggregat av olika storlekar kan användas i analysen, eftersom det inte finns någon signifikant korrelation mellan storleken på aggregaten och migrationsavstånd (våra opublicerade observationer). Att visualisera och ytterligare undersöka dynamiken i neuroblast migration, kan användas time-lapse avbildning. Det rekommenderas att utföra analyser av migration inom en 24 tim intervall efter inbäddning, eftersom hastigheten på neuroblaster verkar drastiskt minska på längre tidpunkter (våra opublicerade observationer). </ P>
Det finns vissa begränsningar i detta protokoll. Först kan nucleofection hittills användas för tidiga postnatala gnagar neuroblaster, medan infektion med virala vektorer är fortfarande den mest effektiva transfektion metod för vuxna neuroblaster 28. För det andra innebär migration vitro-analys av i inte helt återge den komplexa arkitekturen av RMS observerats in vivo. I själva verket, även om neuroblaster upprätthålla förmågan att migrera på ett liknande sätt till deras in vivo motsvarigheter, i experimentuppställning som beskrivs här de saknar interaktioner med andra RMS komponenter såsom astrocyter och blodkärl, vilket också bidrar till att reglera deras rörlighet 9,29, 30. Denna fråga kan behandlas i framtiden genom optimering av tredimensionella coculture modellsystem.
Sammanfattningsvis kombinerar nucleofection med en 3D-analys migration utgör ett värdefullt verktyg för att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakomneuroblast migration. Denna experimentella procedur ger en första, snabb och relativt enkel metod för att utvärdera vilken roll kandidat regulatorer av neuroblast migration, vilket kan vara ytterligare valideras av andra metoder som in vivo-postnatal elektroporering och time-lapse avbildning av hjärnan skiva kulturer 28,31,32 .
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av en Wellcome Trust Project Grant delas PD och GL (089236/Z/09/Z). SG fick stöd av ett bioteknik och Biological Sciences Research Council doktorand. Vi tackar Matthieu Vermeren för slags gåva av shRNA vektorn och Jennifer Shieh för värdefulla råd om neuroblast nucleofection.
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen Life Technologies | 14175129 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Life Technologies | 15140-122 | |
2.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15090-046 | store 200 µl aliquots at -20 °C |
DNAse I Vial (D2) | Worthington | LK003170 | ≥1,000 units per vial; store 50 µl aliquots at -20 °C |
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Hyclone | SH3007902 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
D-(+)-Glucose solution (45%) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Growth Factor Reduced (GFR), Phenol Red-free, 10 ml, LDEV-Free | BD Biosciences | 356231 | prepare 120 µl aliquots at 4 °C, then store at -80 °C |
PFA | Sigma-Aldrich | 441242 | |
Sucrose | BDH | 102745C | |
Goat serum | Sigma-Aldrich | 69023 | |
Triton X-100 | VWR International Ltd. | 306324N | |
BSA | Fisher Chemical | BPE9701-100 | |
Dako fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Rat neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1003 | |
Mouse neuron nucleofection kit | Lonza | VPG-1001 | |
Microsurgical knife | Angiotech | 7516 | |
McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Company | ||
Nucleofector II | Lonza |