التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لتحديد عدد سكانها enucleating الأرومة الحمراء سوي اللون عن طريق التدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، وتوفير التصور لعملية استئصال أرومة الحمراء.
Abstract
الكريات الحمر في الثدييات يختتم عملية دراماتيكية من قلع التي تؤدي الى تكوين الخلايا الشبكية. آلية قلع لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. وهناك مشكلة مشتركة واجهت عند دراسة توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating بواسطة المجهر هو صعوبة مراقبة عدد كاف من الخلايا التي تمر قلع. قمنا بتطوير بروتوكول تحليل رواية باستخدام multiparameter التصوير الخلية عالية السرعة في تدفق (متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي)، وهو الأسلوب الذي يجمع بين مناعي المجهري مع التدفق الخلوي، من أجل تحديد كفاءة عدد كبير من enucleating الأحداث، التي تسمح ل الحصول على القياسات وإجراء التحليل الإحصائي.
علينا أولا وصف هنا اثنين في المختبر الكريات الحمر أساليب الثقافة استخدامها من أجل مزامنة الأرومة الحمراء الفئران وزيادة احتمال التقاط قلع في الالوقت (ه) من التقييم. ثم، نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف. جنبا إلى جنب مع حجم وDNA/Ter119 تلطيخ التي تستخدم لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون، ونحن الاستفادة من المعلمات "نسبة الارتفاع" خلية في القناة مشرق الميدان أن يساعد في التعرف على الخلايا ممدود و "دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/Draq5 "الذي يسمح بتحديد الأحداث الخلوية التي وسط Ter119 تلطيخ (الخلايا الشبكية الوليدة) هو متباعدة من وسط Draq5 تلطيخ (نواة تمر قذف)، مما يدل على أن الخلية على وشك أن استأصل. يتم التخصيب مجموعة فرعية من السكان أرومة الحمراء السوية التلون مع ارتفاع النقطه الوسطى الدلتا ونسبة الارتفاع المنخفض في enucleating الخلايا.
Introduction
التمايز النهائي ضمن النسب محمر في الثدييات يختتم عملية مثيرة للقلع، التي من خلالها أرومة الحمراء السوية التلون يطرد نواة المغطى الغشاء (pyrenocyte) 1، وتوليد الخلايا الشبكية 2. الآلية الدقيقة لهذه العملية، والذي هو أيضا خطوة تحد من معدل النجاح، وعلى نطاق واسع، وإنتاج خلايا الدم الحمراء في المختبر، لم يتم حتى الآن توضيح بالكامل. توطين البروتينات والهياكل الرئيسية في الأرومة الحمراء enucleating تعتمد على استخدام الفلورسنت والإلكترون المجهري 3-5. النتائج هذه عملية شاقة عادة في التعرف على عدد محدود من الأحداث وقلع لا تسمح دائما التحليل الإحصائي ذات مغزى. التوسع في طريقة لتحديد أرومة الحمراء وصفت من قبل ماكغراث وآخرون. 6، وقد وضعنا نهجا جديدا لتحديد ودراسة الأحداث من قبل قلع متعددة الأطياف إيماجينج التدفق الخلوي (multiparameter عالية السرعة التصوير الخلية في التدفق، والأسلوب الذي يجمع بين المجهر الفلورسنت مع التدفق الخلوي) 7، والتي يمكن أن توفر عدد كاف من الملاحظات للحصول على قياسات وتحليل احصائى.
هنا، نحن تصف الأولين في المختبر الكريات الحمر الأساليب المستخدمة في ثقافة أجل مزامنة الأرومة الحمراء وزيادة احتمال التقاط قلع في وقت التقييم. ثم نحن تصف بالتفصيل تلطيخ الأرومة الحمراء بعد تثبيت وpermeabilization من أجل دراسة توطين البروتينات داخل الخلايا أو الطوافات الدهنية خلال قلع بواسطة التدفق الخلوي التصوير متعددة الأطياف.
يتم تشغيل العينات على تدفق عداد الكريات والتصوير هي بوابات الخلايا التي تم جمعها بشكل مناسب لتحديد الأرومة الحمراء سوي اللون 6. ثم يتم تحليل الأرومة الحمراء سوي اللون على أساس نسبة الارتفاع، والتي تقاس في brightfield معهد العالم العربيجينج، مقابل قيمتها لدلتا المعلمة النقطه الوسطى XY Ter119 الحمض النووي، الذي يعرف بأنه المسافة بين مراكز المناطق الملون لTer119 والحمض النووي، على التوالي. يتم التخصيب السكان من الخلايا مع نسبة الارتفاع المنخفضة والعالية دلتا النقطه الوسطى XY Ter119/DNA في enucleating الخلايا. باستخدام البرية من نوع (WT) الأرومة الحمراء مقابل الأرومة الحمراء مع MX-لجنة المساواة العرقية بوساطة الشرطي حذف RAC1 على Rac2 – / – أو مجتمعة Rac2 – / -؛ Rac3 – / – الخلفية الوراثية وهذا البروتوكول تحليل رواية من تدفق التصوير متعددة الأطياف الخلوي، ونحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن استئصال يشبه الانقسام السيتوبلازمي غير المتماثلة وأن تشكيل عصابة أكتوميوزين ينظم في جزء من راك GTPases مهم لتطور قلع 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
في السنوات الأخيرة اكتسبت دراسة قلع أرومة الحمراء الزخم المتزايد لأنها هي خطوة في المختبر في الثقافات الكريات الحمر وهذا هو الأكثر صعوبة في إعادة إنتاج بكفاءة من أجل تحقيق النجاح والإنتاج على نطاق واسع من خلايا الدم الحمراء خارج الحي. حتى وقت قريب، ودراسة ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر التدفق الخلوي البحوث الأساسية في مؤسسة سينسيناتي مستشفى الأطفال في البحوث وريتشارد ماركو، Sherree صديق، وسكوت مردخاي من مؤسسة Amnis (جزء من EMD Milllipore) للحصول على الدعم الفني من الخبراء. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح K08HL088126 وR01HL116352 (TAK) وDK090971 P30 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
Riferimenti
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
