Identification d'une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux
Summary
Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes.
Abstract
Érythropoïèse chez les mammifères conclut avec le processus dramatique de l'énucléation qui aboutit à la formation de réticulocytes. Le mécanisme d'énucléation n'a pas encore été complètement élucidé. Un problème fréquemment rencontré lors de l'étude de la localisation des protéines et des structures clés au sein énucléation des érythroblastes par microscopie est la difficulté d'observer un nombre suffisant de cellules subissant une énucléation. Nous avons développé un nouveau protocole d'analyse par imagerie multiparamétrique haut débit cellulaire en flux (Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux), une méthode qui combine la microscopie par immunofluorescence avec la cytométrie de flux, afin d'identifier efficacement un nombre important d'événements énucléation, qui permet de obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques.
Nous décrivons d'abord ici deux méthodes de culture in vitro de l'érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes murins et augmenter la probabilité de capture d'énucléation à etemps e de l'évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d'étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale. Avec la taille et DNA/Ter119 coloration qui sont utilisés pour identifier les érythroblastes orthochromatiques, nous utilisons les paramètres "aspect ratio" d'une cellule dans le canal champ lumineux qui aide à la reconnaissance des cellules allongées et "delta barycentre XY Ter119/Draq5 "qui permet l'identification d'événements cellulaires dans lequel le centre de Ter119 coloration (de réticulocytes naissante) est loin en dehors du centre de DRAQ5 coloration (noyau subissant extrusion), indiquant ainsi une cellule sur le enucleate. Le sous-ensemble de la population des érythroblastes orthochromatique avec centre de gravité du delta élevé et un faible rapport d'aspect est fortement enrichie en cellules énucléation.
Introduction
Différenciation terminale à l'intérieur de la lignée érythroïde chez les mammifères se termine par le procédé de l'énucléation dramatique, à travers laquelle le érythroblastes orthochromatic expulse son noyau enveloppé d'une membrane (pyrenocyte) 1, 2, générant une réticulocytes. Le mécanisme exact de ce procédé, qui est également l'étape limitant le taux de succès, à grande échelle, la production de globules rouges du sang in vitro, n'est pas encore complètement élucidé. La localisation des protéines et des structures clés au sein d'énucléation d'érythroblastes repose sur l'utilisation de la fluorescence et microscopie électronique 5.3. Ce processus fastidieux se traduit généralement par l'identification d'un nombre limité d'événements énucléation et ne permet pas toujours une analyse statistique significative. Étendre sur une méthode d'identification des érythroblastes décrit précédemment par McGrath et al. 6, nous avons développé une nouvelle approche de l'identification et l'étude des événements énucléation par Multi-Spectral Imaging cytométrie en flux (multiparamétrique imagerie cellulaire à haut débit de l'écoulement, une méthode qui combine la microscopie à fluorescence avec la cytométrie de flux) 7, qui peut fournir un nombre suffisant d'observations pour obtenir des mesures et effectuer des analyses statistiques.
Ici, nous décrivons deux premières méthodes de culture in vitro de l'érythropoïèse dans utilisés pour synchroniser les érythroblastes et augmenter la probabilité de capture d'énucléation au moment de l'évaluation. Ensuite, nous décrivons en détail la coloration des érythroblastes après fixation et perméabilisation afin d'étudier la localisation des protéines intracellulaires ou radeaux lipidiques pendant énucléation par cytométrie de flux d'imagerie multi-spectrale.
Les échantillons sont analysés sur un flux d'imagerie cytomètre et les cellules recueillies sont déclenchés de manière appropriée pour identifier les érythroblastes orthochromatiques 6. Érythroblastes orthochromatiques sont ensuite analysés en fonction de leur rapport d'aspect, tel que mesuré en fond clair imaging, par rapport à leur valeur pour le paramètre delta centroïde XY Ter119-ADN, qui est définie comme la distance entre les centres des zones tachées pour Ter119 et l'ADN, respectivement. La population de cellules ayant un faible ratio d'aspect et delta haut centre de gravité XY Ter119/DNA est fortement enrichie en cellules énucléation. Utilisation de type sauvage (WT) érythroblastes contre érythroblastes avec suppression Mx-Cre médiation conditionnelle de Rac1 sur Rac2 – / – ou combiné Rac2 – / -; RAC3 – / – fond génétique et ce protocole d'analyse de roman de flux d'imagerie multi-spectrale cytométrie, nous avons récemment démontré que l'énucléation ressemble cytokinèse asymétrique et que la formation d'un anneau de actomyosin réglementé en partie par GTPases Rac est important pour la progression de l'énucléation 7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours des dernières années, l'étude de l'énucléation érythroblastes a gagné en dynamique, car il est l'étape dans des cultures in vitro en l'érythropoïèse qui est le plus difficile à reproduire de manière efficace afin de réaliser avec succès, la production à grande échelle de cellules rouges du sang ex vivo. Jusqu'à récemment, l'étude de l'énucléation des érythroblastes utilisé la microscopie par fluorescence et principalement la cytométrie en fl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le flux de recherche cytométrie de base à l'hôpital Fondation de la recherche pour enfants de Cincinnati et Richard Demarco, Sherree ami, et Scott Mardochée du Amnis Corporation (partie de EMD Millipore) pour le support technique expert. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde K08HL088126 et R01HL116352 (TAK) et P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
Riferimenti
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