Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI'nin Zenginleştir tanımlanması
Summary
Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.
Abstract
Memelilerde Eritropoez retikülosit oluşumuyla sonuçlanan enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. Enükleasyonu mekanizması henüz tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Mikroskopla enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu okuyan karşılaşılan genel bir sorun enükleasyonunu geçiren hücrelerin yeterli sayıda gözlemlemek güçlüğüdür. Bu akışta çok parametreli yüksek hızlı hücre görüntüleme (Fazla Spektral Görüntüleme Flow Cytometry), verimli bir şekilde enucleating etkinlikleri önemli sayıda belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile immünofloresan mikroskopi bir araya getiren bir yöntemi kullanarak yeni bir analiz protokolü geliştirdik, bu sağlar: ölçümler elde ve istatistiksel analiz.
Biz buraya ilk kemirgen eritroblastlarda senkronize ve inci de enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak için kullanılan iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri tarifdeğerlendirme e saati. Daha sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Büyüklüğü ve ortokromatik eritroblastlarda tanımlamak için kullanılır DNA/Ter119 boyama ile birlikte, ince uzun hücreleri ve "delta ağırlık merkezi XY Ter119/Draq5 tanınmasına yardımcı olan, parlak-alan kanal bir hücrenin parametreleri" boy oranı "kullanmaktadır "Bu Ter119 boyama (olgunlaşmamış retikülosit) merkez uzak Draq5 lekeleme (çekirdek yapılan ekstrüzyon) merkezinden olduğu hücresel olaylar, bu nedenle tanımlama aydınlatmak üzere bir hücre gösteren sağlar. Yüksek delta sentroidinden ve düşük boy oranı ile ortokromatik erythroblast nüfusun alt kümesi derece hücreleri enucleating zenginleşmektedir.
Introduction
Memelilerde eritroid soy içinde terminal farklılaşma ortokromatik erythroblast bir retikülosit 2 üreten, kendi membran kaplı çekirdeği (pyrenocyte) 1 kovar hangi aracılığıyla enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. De başarılı oran-sınırlayıcı bir adımdır, bu prosesin mekanizması tam olarak, büyük ölçekli, in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimi, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu floresan ve elektron mikroskobu 3-5 kullanımına dayanır. Bu işlem, tipik olarak sıkıcı enükleasyonu etkinlikleri sınırlı sayıda tanımlanması ile sonuçlanır ve her zaman anlamlı istatistiksel olarak analiz edilmesine izin vermez. McGrath ve ark. 6 tarafından tarif erythroblast kimlik bir yöntem üzerinde genişletilmesi, biz Multi-Spektral Ima tarafından enükleasyonun olayları tanımlama ve okuyan yeni bir yaklaşım geliştirdilerölçümler elde ve istatistiksel analizi gerçekleştirmek için gözlemler yeterli sayıda sağlayabilir retlendirici Sitometrisi (akımında multiparameter yüksek hızlı hücre görüntüleme, akış sitometrisine floresan mikroskopi birleştiren bir yöntem) 7.
Burada, biz eritroblastlarda senkronize ve değerlendirilmesi sırasında enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak amacıyla kullanılan ilk iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar.
Numuneler sitometresiyle bir görüntüleme akış üzerinde çalışan ve toplanan hücreler ortokromatik eritroblastlarda 6 tanımlamak için uygun Geçitli. Aydınlık İMA olarak ölçülen ortokromatik eritroblastlar sonra, onların boy oranına göre dağılımı incelendiğindeging sırasıyla Ter119 ve DNA için lekeli alanların merkezleri arasındaki mesafe olarak tanımlanan parametre delta ağırlık merkezi XY Ter119-DNA, için kendi değerine karşılık. Düşük en-boy oranına ve yüksek delta sentroid XY Ter119/DNA ile hücre nüfusu oldukça hücreleri enucleating zenginleşmektedir. – / – Veya kombine RAC2 – / – wild-tip (WT) kullanarak RAC2 üzerine Rac1 Mx-Cre aracılı koşullu silme ile erythroblasts karşı eritroblastlarda; RAC3 – / -, genetik geçmişi ve multi-spektral görüntüleme akışının bu yeni protokol sitometrisi analizi, son zamanlarda enükleasyonu asimetrik sitokinez ve benzer Rac GTPases kısmen düzenlenmiş bir aktomizin halkasının oluşumu enükleasyonu ilerlemesi 7 için önemli olduğunu ortaya koymuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kırmızı kan hücrelerinin ex vivo başarılı bir şekilde, büyük ölçekli üretim elde etmek için etkili bir şekilde yeniden üretmek için çok zordur erythropoiesis in vitro kültürlerinde adım olduğu Son yıllarda erythroblast enükleasyonu çalışma artan ivme kazanmıştır. Son zamanlara kadar, erythroblast enükleasyonu çalışma esas floresan mikroskobu kullanılmaktadır ve sitometri yöntemleri akar. Floresan mikroskopi yöntemleri, katılımcı moleküllerinin belirlenmesi yard…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar uzman teknik destek için Amnis Corporation'ın (EMD Milllipore parçası) Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı ve Richard Demarco, Sherree Arkadaşlar, ve Scott Mordecai de Araştırma Sitometrisi Core teşekkür. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen K08HL088126 ve R01HL116352 (TAK) verir ve P30 DK090971 (YZ).
Materials
| αMEM medium | CellGro | 15-012-CV | |
| IMDM medium | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30228.01 | |
| Stempro-34 SFM | GIBCO (Life Tech) | 10640 | |
| Stempro-34 nutrient supplement | GIBCO (Life Tech) | 10641-025 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | 512450 | |
| BIT9500 | Stemcell Technologies | 09500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30028.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Hyclone (Thermo Scientific) | SV30010 | |
| L-glutamine | Hyclone (Thermo Scientific) | SH30590.01 | |
| Isothesia (Isoflurane) | Butler-Schein | 029405 | |
| Histopaque 1.083mg/ml | Sigma | 10831 | |
| BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) | BD Biosciences | 555899 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 534064 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP 531-500 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Stem Cell Factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | 213-13 | |
| EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) | AMGEN | available by pharmacy | |
| CD44-FITC antibody | BD Pharmingen | 553133 | |
| CD71-FITC antibody | BD Pharmingen | 553266 | |
| Ter119-PECy7 antibody | BD Pharmingen | 557853 | |
| Phalloidin-AF488 | Invitrogen (Life Technologies) | A12379 | |
| β-tubulin-AF488 antibody | Cell Signaling | #3623 | |
| anti-rabbit AF488-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A11008 | |
| anti-rabbit AF555-secondary antibody | Invitrogen (Life Technologies) | A21428 | |
| AF594-cholera toxin B subunit | Invitrogen (Life Technologies) | C34777 | |
| pMRLC (Ser19) antibody | Cell Signaling | #3671 | |
| γ-tubulin antibody | Sigma | T-3559 | |
| Syto16 | Invitrogen (Life Technologies) | S7578 | |
| Draq5 | Biostatus | DR50200 | |
| Ferrous sulfate | Sigma | F7002 | |
| Ferric nitrate | Sigma | F3002 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 15ml tubes | BD Falcon | 352099 | |
| 50ml tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | BD Falcon | 351147 | |
| Flow tubes | BD Falcon | 352008 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309602 | |
| Insulin syringe | BD | 329461 | |
| Syringe needle 25G5/8 | BD | 305122 | |
| Capped flow tubes | BD | 352058 | |
| 40μm cell strainer | BD Falcon | 352340 | |
| Scalpel (disposable) | Feather | 2975#21 | |
| FACS Canto Flow Cytometer | BD | ||
| ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. | AMNIS (EMD Millipore) | ||
| Hemavet 950 Cell Counter | Drew Scientific | CDC-9950-002 | |
| NAPCO series 8000WJ Incubator | Thermo scientific | ||
| Allegra X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Mini Mouse Bench centrifuge | Denville | C0801 |
Riferimenti
- McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
- Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
- Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
- Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
- McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
- Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
- Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
- Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
- Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
- Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
- Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
- Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).
