ड्रोसोफिला लार्वा के कारण उनके पारदर्शी छल्ली और शक्तिशाली आनुवंशिकी के रहते इमेजिंग के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली रहे हैं. इस प्रोटोकॉल 3 instar ड्रोसोफिला लार्वा के न्यूरॉन्स के भीतर सेलुलर प्रक्रियाओं के रहते इमेजिंग के लिए 'लार्वा चिप' नामक एक एकल परत PDMS डिवाइस, उपयोग कैसे करें.
लाइव इमेजिंग हालांकि यह जीवित पशुओं में चुनौतीपूर्ण हो सकता है सेल जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है. ड्रोसोफिला लार्वा की पारदर्शी छल्ली यह लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए एक आकर्षक मॉडल जीव बनाता है. बहरहाल, लाइव इमेजिंग तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती noninvasively स्थिर और माइक्रोस्कोप पर एक जानवर की स्थिति है. इस प्रोटोकॉल एक polydimethylsiloxane हम 'लार्वा चिप' कहते हैं (PDMS) microfluidic डिवाइस, पर ड्रोसोफिला लार्वा immobilizing और इमेजिंग के लिए एक सरल और प्रयोग करने में आसान विधि प्रस्तुत करता है. लार्वा चिप एक सिरिंज के माध्यम से एक निर्वात के आवेदन पर, पशु immobilizes और इस तरह के तंत्रिका कॉर्ड, कमानी नसों, और शरीर के रूप में उदर संरचनाओं लाता है, जो एक पतली गिलास coverslip, से जुड़ा हुआ है कि एक सुखद ढाले PDMS microchamber के शामिल है coverslip के करीब निकटता के भीतर दीवार की मांसपेशियों,. इस उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, और महत्वपूर्ण बात, ane के प्रयोग से बचा जाता हैशारीरिक प्रक्रियाओं की एक व्यापक श्रेणी के अध्ययन की सुविधा जो sthetics और रसायन,. लार्वा स्थिरीकरण से आसानी से उबरने के बाद से, वे आसानी से कई इमेजिंग सत्र के अधीन किया जा सकता है. इस घंटे से दिन को लेकर समय पाठ्यक्रम से अधिक अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल कदम दर कदम चिप और कैसे 3 instar लार्वा में neuronal घटनाओं के लाइव इमेजिंग के लिए चिप का उपयोग करने के लिए तैयार करने के लिए कैसे करें. इन घटनाओं axons, चोट करने के लिए कैल्शियम की प्रतिक्रियाएं, और लंबी दूरी और समय के तराजू से अधिक फोटो परिवर्तनीय प्रोटीन की तस्करी का समय व्यतीत हो पढ़ाई में organelles की तेजी से परिवहन शामिल हैं. चिप का एक अन्य आवेदन पुनर्योजी और axonal चोट के अपक्षयी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए है, इसलिए इस प्रोटोकॉल का दूसरा भाग एक कमानी तंत्रिका कुचलने से परिधीय नसों के भीतर axons घायल के लिए एक नया और सरल प्रक्रिया का वर्णन है.
फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, 100 से अधिक वर्षों के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उपयोग किया गया है, और मौलिक संकेतन और अकशेरुकी से मानव को संरक्षित कर रहे हैं कि विकास के रास्ते को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई साबित कर दिया है. विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त करने के लिए उपलब्ध कई आनुवंशिक उपकरण हैं, खासकर इसलिए लाइव इमेजिंग सेलुलर तंत्र के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है, और सरल शरीर योजना और ड्रोसोफिला लार्वा की पारदर्शी छल्ली यह लाइव इमेजिंग के लिए एक आकर्षक व्यवस्था करता है.
लाइव इमेजिंग तकनीक के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती noninvasively स्थिर और माइक्रोस्कोपी के लिए एक जानवर की स्थिति है. परम्परागत स्थिरीकरण दृष्टिकोण जानवर को मार, जो दोनों के विच्छेदन 1,2 या क्लोरोफॉर्म का उपयोग शामिल है. निश्चेतक ईथर 4 और isofluorane 5-8 भी इस्तेमाल किया गया है. निश्चेतक कई लाभ प्रदान करते हैं, वे भी इसलिए अध्ययन प्रक्रिया को प्रभावित और जानवर पर तनाव बना सकते हैं, तंत्रिका गतिविधि और (दिल की धड़कन सहित) महत्वपूर्ण फिजियोलॉजी 9-11 रोकना. आकाश और isofluorane के साथ काम करने के लिए मानव सुरक्षा चिंताओं भी कर रहे हैं.
हम 'लार्वा' चिप 12 कॉल जो एक परत PDMS microfluidic डिवाइस, में ड्रोसोफिला लार्वा को स्थिर करने के लिए एक दवा मुक्त विधि विकसित की है. इस प्रोटोकॉल प्राप्त या लार्वा चिप बनाने का वर्णन कैसे होगा, और जल्दी मंचन 3 instar लार्वा में रहते इमेजिंग के लिए इसे उपयोग करने के लिए कैसे. चिप एक सिरिंज के माध्यम से एक निर्वात के आवेदन पर, कोमल यांत्रिक शक्ति के माध्यम से पशु immobilizes है, जो एक सुखद ढाले microchamber, के शामिल है. स्थिरीकरण विधि ऐसी एक गिलास coverslip के करीब निकटता के भीतर तंत्रिका कॉर्ड, कमानी नसों, और शरीर दीवार की मांसपेशियों के रूप में उदर संरचनाओं लाता है. इस उच्च संख्यात्मक कोल के साथ ऐसी संरचनाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता हैसंरचना (उच्च वृद्धि) के उद्देश्यों.
(मैं) लार्वा चिप के प्रयोग unanesthetized जानवरों के vivo इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, रसायनों के उपयोग को बदल देता है: अन्य परम्परागत तकनीकों से अधिक लार्वा चिप के लाभ में निम्न शामिल हैं. (Ii) लार्वा तुरंत (isofluorane 8,13 के लिए एक 2 घंटा वसूली की अवधि के विपरीत) चिप से रिहाई के बाद ठीक हो. इस घंटे और दिन के लिए, मिलीसेकंड से मिनट से लेकर व्यापक समय तराजू, अधिक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. (Iii) एक गैस पारगम्य सामग्री है जो PDMS, का उपयोग लार्वा शरीर में वातावरण से ऑक्सीजन / हवा के निरंतर प्रसार के लिए सक्षम बनाता है. (Iv) चिप का उपयोग करने के लिए आसान और सुरक्षित है, और (v) यह पुन: प्रयोज्य है, और एक कम कीमत पर निर्मित किया जा सकता.
लार्वा चिप का उपयोग के लिए निर्देश के अलावा, इस प्रोटोकॉल 3 instar लार्वा में neuronal घटनाओं का अध्ययन करने के लिए इसके उपयोग के कई उदाहरण प्रदान करेगा. ये axona का जीना इमेजिंग शामिलएल परिवहन, चोट करने के लिए कैल्शियम की प्रतिक्रियाएं, और लंबी दूरी और समय के तराजू से अधिक फोटो परिवर्तनीय प्रोटीन की तस्करी का समय व्यतीत हो पढ़ाई.
चिप का एक अन्य आवेदन axonal चोट करने के लिए neuronal प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए है. इस के लिए एक अतिरिक्त प्रक्रिया एक कमानी तंत्रिका कुचलने से परिधीय नसों के भीतर axons घायल के लिए (भाग 3) में वर्णित है. यह सरल परख एक ही समय में संसाधित करने के लिए कई जानवरों के लिए अनुमति देता है एक मानक विच्छेदन stereomicroscope के तहत दोनों तेजी से और reproducibly किया जा सकता है. चोट के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं लार्वा चिप में रहते इमेजिंग द्वारा अध्ययन किया जा सकता है.
बनाना या लार्वा चिप प्राप्त:
लार्वा चिप एक गिलास coverslip से जुड़ी एक PDMS ब्लॉक ('PDMS चिप' कहा जाता है) के होते हैं. चरण 1 में प्रोटोकॉल बनाने और लार्वा चिप्स का उपयोग कर, एक SU-8 ढालना उपलब्ध है संभालने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है. SU-8 ढालना photolithographically (विवरण Ghannad-Rezaie एट अल. 12 देखने के लिए) एक सिलिकॉन वेफर पर एक 140 माइक्रोन मोटी SU-8 photoresist परत patterning द्वारा microfabricated है. SU-8 मोल्ड के microfabrication विशेष उपकरणों का उपयोग करने की आवश्यकता है, हम एक microfabrication सुविधा से यह आदेश देने की सलाह देते हैं (उदाहरण के लिए. मिशिगन 14 विश्वविद्यालय में LNF सुविधा), या उन्हें प्रदान की जाती है कि चिप डिजाइन भेजकर एक फाउंड्री से एक अनुपूरक फ़ाइल के रूप में. एक (विभिन्न आकार के लार्वा के साथ प्रयोग के लिए जैसे) PDMS चिप डिजाइन, DXF फ़ाइलों (जैसे ऑटोकैड) संभालती है कि एक सीएडी सॉफ्टवेयर बदलने के लिए चाहता है में इस्तेमाल किया जा सकता है. एक एसयू8 ढालना भी मंडल में निर्देशों का पालन घर में बनाया जा सकता है एट अल. 27 कई पाठकों के लिए यह सुविधाजनक बस अपने स्वयं के चिप्स fabricating से पहले तकनीक बाहर की कोशिश करने के लिए एक नमूना PDMS चिप प्राप्त करने के लिए मिल सकता है. इस अनुरोध पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध कराया जाएगा.
लाइव इमेजिंग के लिए microfluidic 'लार्वा' चिप का प्रयोग करें:
लार्वा चिप में स्थिरीकरण विधि anesthetics के प्रयोग से बचा जाता है, और बदले जानवर के आंदोलन को प्रतिबंधित करने के लिए, एक वैक्यूम के आवेदन के माध्यम से, दबाव शामिल है. जानवरों के लिए कई घंटे 12, एक छोटी स्थिरीकरण अवधि (5-15 मिनट) के लिए चिप में स्थिरीकरण जीवित रह सकते हैं सिफारिश की है. इस intracellular कैल्शियम में परिवर्तन, या तेजी axonal परिवहन सहित हित के कई सेलुलर घटनाओं, इमेजिंग के लिए पर्याप्त समय है. यह भी इस तरह के लेजर आधारित microsurgery, photobleaching, और photoconver के रूप में जीवित पशुओं में वांछित जोड़तोड़, के लिए पर्याप्त समय हैसायन.
Longitudinally एक भी पशु में एक लंबे समय अवधि से अधिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, जानवरों आराम की अवधि के द्वारा अलग, कई बार चिप में रखा जाता है और imaged किया जा सकता है. वे एक आसान खाद्य स्रोत और नमी प्रदान के रूप में अंगूर का रस अगर प्लेटें, इमेजिंग सत्र के बीच में आराम के लिए आदर्श होते हैं. प्रत्येक सत्र (नीचे, समस्या निवारण में भाग 2 देखें) जानवर को नुकसान पहुँचाए के लिए कुछ जोखिम वहन करती है के बाद से कई इमेजिंग सत्र, एक हद तक लार्वा अस्तित्व को प्रभावित करते हैं. पशु नियमित रूप से एक 50% से अधिक जीवित रहने की दर के साथ दो दिनों के दौरान अधिक> 5 बार imaged किया जा सकता है. जानवरों anesthetized नहीं कर रहे हैं, वे तुरंत चिप में वैक्यूम की रिहाई के बाद स्वस्थ और गतिशील होते हैं. वहाँ इमेजिंग सत्र के बीच वसूली समय के लिए कोई ज़रूरत इसलिए है, तो सत्र के बीच के समय में अंतर रखने लचीला है और प्रयोग के उद्देश्यों को समायोजित किया जा सकता है.
समस्या निवारण:
सबसे आम तकनीकी हैलार्वा चिप और सिफारिश समाधान अनुसरण कर रहे हैं के साथ मुद्दों:
(1) पशु भी ज्यादा बढ़ रहा है. बहुत ज्यादा गतिशीलता इमेजिंग लक्ष्यों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. लार्वा चिप में इस बात के लिए सबसे सामान्य कारणों में से एक) पशु चिप के लिए बहुत छोटा है, या ख) स्थिरीकरण चरण के दौरान लागू वैक्यूम दबाव के साथ छेड़छाड़ की है. जल्दी 3 instar लार्वा मंचन के लिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित लार्वा चिप बनाया गया है. पशुओं के लिए अधिकतम आकार (अग्रपश्चस्थ अक्ष के साथ) की लंबाई में 3.5-4 मिमी है. प्रतिरोध संभाल में महसूस किया है जब तक वैक्यूम दबाव पर्याप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, सिरिंज 2-2.5 मिलीलीटर खींच, या. वैक्यूम काम कर रहा है कि एक संकेत परिधि चैनल में छोटे बुलबुले वैक्यूम स्रोत की ओर धीरे – धीरे बढ़ देखा जा सकता है. एक और संकेत चिप (ऊपर से उठाया है जब coverslip हमेशा चिप के साथ यात्रा करना चाहिए और इस कक्ष के परिवहन के लिए अनुशंसित विधि हैलार्वा तैनात है और निर्वात) पर है एक बार. ट्यूबिंग में दरारें हैं, तो वैक्यूम समझौता किया जा सकता है, या तेल ट्यूबिंग में अगर वहाँ. यह आसानी से (कदम 1.6-1.14 से) सुई टिप और पॉलीथीन-50 ट्यूबिंग वितरण 23 ग्राम की जगह से संबोधित किया जा सकता है.
(2) पशु चिप में इमेजिंग के बाद मर जाता है. प्रक्रिया जानवर पर कम से कम तनाव पैदा करने का इरादा है, और जंगली प्रकार जीनोटाइप के जानवरों के भी चिप 12 स्थिरीकरण के एक घंटे के बाद, एक> 90% जीवित रहने की दर है है. कुछ जीनोटाइप चिप का तनाव कम करने के लिए लचीला हो सकता है, के बाद से पहली बार जंगली जानवरों (उदाहरण के लिए, एस गुआंगज़ौ) स्थिरीकरण तकनीक जीवित रहते हैं कि जांच ले. एक) मारक के लिए सबसे आम कारण लार्वा की गलत स्थिति (आंकड़े 2 जी एच देखें) है. छल्ली, सिर या ट्रेकिआ के कुछ हिस्सों कक्ष के भीतर पूरी तरह से नहीं कर रहे हैं, तो वे स्थिरीकरण के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है, और एक कर सकते हैंचिप (> 4 मिमी) के लिए बहुत बड़ी है कि लार्वा जीवित रहने की संभावना कम होती है. ख) मारक के लिए एक कम आम कारण बहुत अधिक दबाव या वैक्यूम चिप लोड करते समय का उपयोग है. ठीक से चिप में तैनात है, जब निर्वात द्वारा उत्पन्न दबाव अच्छी तरह से सहन किया है. हालांकि वैक्यूम से या जानवर को स्थिति के प्रारंभिक चरण में या तो अत्यधिक दबाव, एक मुद्दा हो सकता है. यह सही आकार की जंगली प्रकार लार्वा के साथ परीक्षण से empirically जरूरत दबाव की डिग्री सीखने के लिए सबसे अच्छा है. बहुत ज्यादा हेलोकार्बन तेल जानवर की श्वासनली को शामिल किया गया, तो सी) पशु संभावित लंबे समय तक जीवित रहने के साथ मुद्दों हो सकता है. यह निर्वात की रचना, इमेजिंग दौरान प्रकाशिकी के लिए महत्वपूर्ण है, और यह चिप में सुखाना counteracts: तेल चिप में कई महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. हालांकि अत्यधिक तेल से बचा जाना चाहिए. (यह भी वैक्यूम समझौता किए, ट्यूबिंग और सिरिंज में तेल के लिए नेतृत्व कर सकते हैं). तेल के साथ लार्वा का सिर्फ उदर पक्ष सुझाव दिया प्रोटोकॉल कोट, फिर rइमेजिंग के लिए अंतिम coverslip करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले एक साफ coverslip पर लार्वा की नियुक्ति से अतिरिक्त तेल emoves. घ) phototoxicity इमेजिंग सत्र से अनुभव किया जा सकता है. किसी भी जीवित इमेजिंग आवेदन के साथ के रूप में, यह सबसे अच्छा है एक बेहद संवेदनशील कैमरा या डिटेक्टर का उपयोग कर हासिल की है जो कम तीव्रता लेजर प्रकाश, के साथ कम जोखिम बार उपयोग करने के लिए आदर्श है. पारा प्रकाश स्रोतों के द्वारा बनाई गई व्यापक स्पेक्ट्रम प्रकाश सहित, यूवी प्रकाश के साथ रोशनी कम करने की कोशिश.
अन्य मुद्दों और भविष्य दिशाओं:
इस विधि निश्चेतक का उपयोग नहीं करता है, जानवर के दिल की धड़कन बना हुआ है. यह और अधिक दूसरों की तुलना में कुछ स्थानों में इमेजिंग को प्रभावित करता है, जो कुछ अपरिहार्य गतिशीलता, बनाता है. यहाँ उदाहरण उदर तंत्रिका कॉर्ड, कमानी नसों, और शरीर दीवार आसानी से दिल की धड़कन से हस्तक्षेप के बिना imaged किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. दिल की धड़कन इमेजिंग को प्रभावित करता है, जहां मामलों में, नियमित आंदोलनों कभी कभी के साथ के लिए सही किया जा सकता हैविश्लेषण सॉफ्टवेयर में (उदाहरण के लिए, ImageJ के लिए छवि स्थिरता प्लगइन). व्यक्ति वस्तुओं (घंटे मिनट) एक तेजी से समय पैमाने (तेज axonal परिवहन के लिए उदाहरण के लिए ~ 1 माइक्रोन / सेक) पर या एक बहुत ही धीमी गति से समय स्केल पर आगे बढ़ रहे हैं जब यह अच्छी तरह से काम करता है. हालांकि, जब वस्तु (एस) गति और दिशाओं की एक सीमा के साथ ब्याज के, यह दिल की धड़कन प्रेरित आंदोलनों के लिए सही करने के लिए कठिन हो सकता है.
एक और मुद्दा जानवर से जानवर के लिए, या चिप में एक ही पशु के कई इमेजिंग सत्र के बीच प्रकाशिकी में मामूली परिवर्तनशीलता है. गहरी रुचि की वस्तु जानवर के भीतर है, अधिक से अधिक इस बदलाव हो जाएगा. कमानी नसों और उदर तंत्रिका कॉर्ड भी गहरी एक नियमित माइक्रोस्कोप पर imaged किया जा तो जानवर के भीतर सामान्य रूप से कर रहे हैं. बहरहाल लार्वा चिप में अनुभवी हल्के दबाव के बहुत करीब छल्ली और coverslip करने के लिए इन संरचनाओं धक्का. coverslip से इन संरचनाओं की सही दूरी टीआर से छोटे बदलाव होगापरीक्षण करने के लिए ial. वस्तुओं के लिए परिवर्तन ऐसे संवेदी न्यूरॉन्स सेल निकायों के रूप में, छल्ली बंद, कम है. यह प्रकाशिकी में परिवर्तनशीलता के लिए खाते में जानवरों और स्वतंत्र परीक्षणों की एक बड़ी संख्या का उपयोग करने के लिए, विशेष रूप से तीव्रता की माप बनाने के लिए, इसलिए यह महत्वपूर्ण है.
यहाँ दिखाए गए उदाहरण न्यूरॉन्स के भीतर प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, दृष्टिकोण खुर्दबीन उद्देश्य का ध्यान केंद्रित गहराई में लाया जा सकता है कि पशुओं में किसी भी संरचना इमेजिंग के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. इस छल्ली, शरीर दीवार मांसपेशियों, और उनके NMJs शामिल हैं. पशु के उदर पक्ष पर ट्रेकिआ और संभवतः पाचन तंत्र के कुछ हिस्सों में भी imaged किया जा सकता है. जानवर भी पृष्ठीय सतह के पास संरचनाओं के लघु अवधि के इमेजिंग के लिए coverslip प्रति अपनी पृष्ठीय पक्ष के साथ तैनात किया जा सकता है. गहरे जानवर के भीतर छवि संरचनाओं करने की क्षमता का इस्तेमाल किया खुर्दबीन उद्देश्य के काम दूरी तक सीमित है. ऐसे im के रूप में संरचनाएंaginal डिस्क उच्च वृद्धि (जैसे 40x) उद्देश्यों के लिए दुर्गम हैं.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित लार्वा चिप्स (3.5-4 मिमी से आकार में लेकर) जल्दी 3 instar चरण में लार्वा के लिए तैयार कर रहे हैं. हालांकि कई दिलचस्प सवालों अलग लार्वा चरणों में इमेजिंग की आवश्यकता होती है. देर से 3 instars समायोजित करने के लिए 2 एन डी instar लार्वा, या बड़ा चिप्स को समायोजित करने के लिए छोटे चिप्स आसानी से एक ही सिद्धांत का उपयोग कर बनाया जा सकता है. (अनुपूरक चित्रा 1 बदल कक्ष आकार के साथ सिलिकॉन molds बनाने के लिए एक आसानी से परिवर्तनीय DXF फ़ाइल शामिल हैं). प्रतिवर्ती मुहर के सरल सिद्धांत भी ऐसे सी के रूप में अन्य जीवों के लिए लागू किया जा सकता है मुख्य संस्करण कक्ष आकार होने के साथ एलिगेंस या zebrafish,. एक उपयोगी भविष्य की दिशा स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए उपयोग करने के लिए एक ही बार में कई जानवरों को स्थिर कर सकते हैं कि एक चिप डिजाइन करने के लिए है. हालांकि, इसके लिए डिजाइन काफी अलग होने की आवश्यकता होगीचिप में जानवर को स्थिति के मुद्दों पर स्वतंत्र रूप से एक पशु के लिए के साथ निपटा जाना चाहिए जहां वर्तमान डिवाइस, से.
लार्वा परिधीय नसों में चोट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन के लिए तंत्रिका कुचलने परख:
लार्वा कमानी नसों के लिए यहाँ वर्णित तंत्रिका कुचलने परख ड्रोसोफिला में परिधीय axons के लिए एक चोट शुरू करने के लिए एक सरल तरीका है. इस विधि के लाभ में शामिल हैं: एक) यह एक ड्रोसोफिला प्रयोगशाला (एक stereomicroscope सीओ 2 स्रोत और संदंश) में पाया मानक उपकरण के साथ संचालन करने के लिए सरल है, ख) यह चोट के बाद तंत्रिका डोरियों के जैव रासायनिक विश्लेषण कर रही है, कई जानवरों के लिए जल्दी से आयोजित किया जा सकता है 14 व्यवहार्य, ग) इस चोट के आणविक और सेलुलर प्रतिक्रियाओं 14,15,28 अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और हड्डीवाला न्यूरॉन्स 29,30 में भी महत्वपूर्ण हैं कि प्रक्रियाओं की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
न्यूरॉन्स घायल करने के वैकल्पिक तरीके केंद्रित करने के लिए हैसा उच्च शक्ति लेजर, उदाहरण के लिए लेजर microsurgery 17,31-33 के माध्यम से एक अक्षतंतु तोड़ एक स्पंदित यूवी या femtosecond लेजर,. लार्वा चिप ऐसे microsurgery के लिए पशु स्थिति के लिए एक आदर्श तरीका है. हालांकि, क्योंकि ऊपर चर्चा परीक्षणों के बीच प्रकाशिकी, में मामूली अंतर से, लेजर आधारित पद्धति विशेष रूप से लार्वा कमानी नसों में, लार्वा में पुन: पेश करने के लिए और अधिक कठिन हो सकता है. इसके अलावा, लेजर आधारित axonal चोट, प्रत्येक जानवर की स्थिति के लिए और अधिक समय की आवश्यकता है, इसलिए (जानवरों की एक बड़ी संख्या के साथ) एक बड़े पैमाने पर संचालन करने के लिए और अधिक कठिन है.
समस्या निवारण:
तंत्रिका कुचलने से सबसे अधिक सामना करना पड़ा तकनीकी समस्या के आंतरिक अंगों को नुकसान से मौत है. कुचलने का आयोजन करते हैं, तो यह उदर तंत्रिका कॉर्ड, लार ग्रंथियों, या आंतों चुटकी महत्वपूर्ण नहीं है. यह छल्ली पंचर नहीं भी महत्वपूर्ण है. इन मुद्दों को सबसे अच्छा छल्ली surfac के लिए एक 45 डिग्री के कोण पर संदंश लाकर परहेज कर रहे हैंई (चित्रा 3 देखें).
संदंश की गुणवत्ता बाद में कुचलने और अस्तित्व की प्रभावशीलता पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है. हम Dumostar संख्या 5 संदंश की सलाह देते हैं. उनके तीखेपन को बनाए रखने के लिए, संदंश, ध्यान से संभाला अन्य प्रयोजनों के लिए उपयोग नहीं किया, और वे कुंद या तुला बन एक बार बदला जाना चाहिए.
जानवर के आकार को भी कुचलने की प्रभावशीलता को प्रभावित कर सकते हैं. छोटे जानवरों (लंबाई में कम से कम 3 मिमी) बहुत कम संभावना चोट जीवित रहने के लिए कर रहे हैं. बड़े जानवरों के साथ, (3 instars भटक), यह नसों लगाने और बड़ा लार ग्रंथियों और आंतों को नुकसान से बचने के लिए और अधिक कठिन है, और पोटा बनना से पहले चोट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए कम समय है. तंत्रिका को कुचलने के सबसे प्रभावी रूप से जल्दी 3 instar लार्वा में आयोजित किया जाता है (जो कर रहे हैं ~ अग्रपश्चस्थ अक्ष के साथ लंबाई में 3-4.5 मिमी).
पशु पर उठाया है कि खाद्य स्रोत को प्रभावित कर सकताकुचलने के बाद छल्ली और अस्तित्व की ताकत. यह एक मानक खमीर ग्लूकोज नुस्खा से बना भोजन में पशुओं को उठाने की सिफारिश की है.
प्रभावी ढंग से कुचलने करने के लिए सीखने के लिए सबसे अच्छा तरीका पहले प्राथमिक अस्तित्व को प्राप्त करने का लक्ष्य (और नहीं प्यूपीकरण) कुचलने के बाद 24 घंटे के साथ, कई जानवरों पर अभ्यास करने के लिए है. शुरुआती सामान्य रूप से एक कम जीवित रहने की दर (जैसे 10%) है, लेकिन तकनीक सीखा है एक बार, जीवित रहने की दरों ~ 90% तक पहुँच सकते हैं.
अन्य मुद्दों और भविष्य दिशाओं:
क्रश परख चोट साइट और axons और चोट साइट के लिए बाहर का synapses के अध: पतन के लिए अक्षतंतु समीपस्थ का अंकुरण अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है. अध: पतन की दरें अलग न्यूरॉन प्रकार के बीच में भिन्नता है, वे चोट परख के reproducibility के लिए आदेश प्रदान करने, एक दिया न्यूरॉन प्रकार के भीतर अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं.
इसके विपरीत, 'पुनर्योजी' अंकुरणसमीपस्थ axons में मनाया प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण है. कमानी तंत्रिका में सभी axons (उदाहरण के लिए, चित्रा 6 और चित्रा 3 देखें) चोट स्थल के करीब अंकुरण व्यापक आरंभ. हालांकि अंकुरण की हद न्यूरॉन से न्यूरॉन करने के लिए अलग अलग है, और जिसका अंदाजा लगाना मुश्किल है सकते हैं. अंकुरण में इसी तरह की डिग्री और परिवर्तनशीलता एक यूवी स्पंदित डाई लेजर का उपयोग करके शुरू की कमानी नसों में एकल motoneurons के अधिक फोकल घावों के बाद देखा जा सकता है. हम अंकुरण की nondiscriminate दिशात्मकता कमानी नसों में मार्गदर्शन संकेत के अभाव के कारण है कि व्याख्या. इसके विपरीत, उनके पास सेल शरीर को लेजर से घायल संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु खो अक्षतंतु 34 के रूप में एक ही दिशा में नई axonal विकास से गुजरना. जानवर के इस क्षेत्र में axons संभावना regenerating axons के मार्गदर्शन के लिए और अधिक विशिष्ट स्थितीय जानकारी के संपर्क में हैं. कमानी नसों के भीतर वातावरण बहुत resemblan है की संभावना नहीं हैमूल रूप से भ्रूण में उनके मार्गदर्शन दौरान navigated axons, इसलिए regenerating axons गाइड करने के लिए जानकारी की उम्मीद नहीं है कि पर्यावरण के लिए CE.
कमानी तंत्रिका कुचलने परख का उपयोग उत्थान के अध्ययन के लिए एक और सीमा घायल संवेदी और motoneuron axons अभी भी पशु undergoes से पहले अपने लक्ष्य तक पहुँचने के लिए (0.25-1 मिमी), और एक सीमित समय सीमा (<3 दिन) को कवर करने के लिए एक महत्वपूर्ण दूरी है प्यूपीकरण. एक ताजा अध्ययन में 3 instar लार्वा चरण 35 की अवधि ट्रिपल जो prothoraciotropic हार्मोन रिसेप्टर के एक आनुवंशिक हेरफेर की पहचान की है. इस हेरफेर 9 के बजाय 3 के दिनों में काफी चोट के बाद न्यूरॉन्स की वसूली और अध: पतन के अध्ययन के लिए समय सीमा का विस्तार होगा. इस चोट synaptic समाप्त होने के करीब प्रेरित है, खासकर अगर इस तरह अपने postsynaptic लक्ष्य के साथ एक घायल अक्षतंतु के कनेक्शन के रूप में नई घटनाओं, निरीक्षण करने के लिए काफी देर तक हो सकता है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम (सीएसी करने के द्वारा करने के लिए R00MH080599, नेकां के लिए R21 NS062313, और NS069844) के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या सीएसी करने IOS-0842701), और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया. हम तकनीकी समर्थन के लिए जेम्स SCHUTT, एमिली हान, और लेनी Truong स्वीकार करना, और मक्खी लाइनों के लिए ब्लूमिंगटन स्टॉक केन्द्र होगा. सभी चिप्स मिशिगन विश्वविद्यालय में Lurie Nanofabrication सुविधा पर गढ़े गए थे.
0.5 mm Polyethylene tubing | Fisher scientific | 14-170-11B | Polyethylene tubing, I.D. = 0.023’’, O.D. = 0.038’’ |
1 mm Polyurethane tubing | Fisher scientific | BB521-63 | Polyurethane tubing, I.D. = 0.063’’, O.D. = 0.125’’ |
barb to barb connector | Bio Rad | 732-8300 | 0.8 mm barb to barb connector |
3-way stopcock valve | Bio Rad | 732-8104 | Screw on valve for the syringe |
Syringe (20 ml) | Fisher scientific | 14-817-33 | Screw on 20 ml syringe for generating vacuum |
Dispensing needles, 23 G (.4mm I.D., .6mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A684 | Needle for outlet connection |
Dispensing needles, 21 G, (.6mm I.D., .8mm O.D.) | McMaster-Carr | 75165A679 | Needle for outlet connection |
Halocarbon oil | Sigma | H8898 | Halocarbon oil 700 |
Dumostar Number 5 Forceps | Roboz | RS-498 | For nerve crush |
PDMS Kit (Base and curing agent) | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant 0.5 kg Kit Clear |
Glass Coverslips | Fisher scientific | 12-544-C | 24 x 40 mm (thickness according to recommendation for your microscope objective) |
Disposable Plastic Cup (9 oz.) | |||
Plastic coffee stirrer stick | |||
Razor Blade | |||
Grape juice agar plates | See http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/4/pdb.rec10925 for recipe |