Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen
Summary
Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolatie van microglia van CZS-weefsel is een krachtig onderzoeksinstrument gebruikt om microglia biologie studeren ex vivo. De huidige methode Gegevens van een procedure voor de isolatie van microglia van neonatale muizen cortex door mechanisch roeren met een roterende schudder. Dit microglia isolatie methode levert zeer zuiver corticale microglia dat morfologische en functionele kenmerken wijzen op latente microglia in normale, nonpathological condities in vivo vertonen. Deze procedure bewaart ook de microgliale immunofenotype en biochemische functies zoals blijkt uit de inductie van morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van de p65 subeenheid van NF-kB (p65), en secretie van de pro-inflammatoire cytokine kenmerk, tumornecrosefactor-α (TNF-α ), na lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam) uitdagingen. Daarom is de huidige isolatie procedure behoudt de immunofenotype van zowel latente en actikeld microglia, die een experimentele methode van onderzoek microglia biologie in ex vivo omstandigheden.
Introduction
Microgliacellen, het toezicht macrofagen van het CZS parenchym, omvatten ongeveer 12% van de totale celpopulatie van de volwassen hersenen van zoogdieren. Microglia zijn afgeleid uit dooierzak myeloïde voorlopercellen en variëren in celdichtheid en morfologie in verschillende cytoarchitectural gebieden binnen de volwassen CZS 1-5. In een gezonde volwassen brein, microglia zijn kleine, vertakte of polaire cellen met fijne, dynamische processen. In tegenstelling tot perifere macrofagen morfologie, microglia tonen een rustige, low-profile fenotype in gezonde hersenen die kunnen worden weergegeven als cellulaire inactiviteit, maar in vivo imaging studies tonen aan dat microglia processen dynamisch en uitschuiven om hun micro-omgeving te controleren op een manier die doet denken aan " bemonstering en landmeetkundige "6,7.
Microglia en zijn zeer verschillend reageren op milieu en pathofysiologische veranderingen in de hersenen, switchingeen toezichthouder van een effector-staat algemeen beschouwd als de rustende en geactiveerde toestanden, respectievelijk. Deze schakelaar activering kan worden gemedieerd door aangrijping van membraangebonden patroonherkenning receptoren (PRRS), zoals toll-like receptoren (TLR's), die beantwoorden aan pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), namelijk bacteriële-en virale afgeleide lipoproteïnen , nucleïnezuren en koolhydraten 8-11. Naast PAMPs zijn PRRS ook aangetoond dat microglia activatie induceren tegen steriel, niet-pathogene moleculen, bekend als gevaar / beschadiging geassocieerde moleculaire patronen (gedempt), die een verstoring in CZS homeostase vertegenwoordigen, zoals cellulaire schade 12-16. Eenmaal geactiveerd, PRRS initiëren een intracellulaire signalerende cascade die leidt tot veranderingen in microgliale cel morfologie en genexpressie, specifiek geactiveerde microglia aan een amoeboid fenotype, verplaatsen de P65 subeenheid NF-kB (p65) naar de celkern, en de upregulate productie en secretie van pro-inflammatoire cytokinen zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-1 β (IL-1β), samen met reactieve zuurstof species (ROS) 16-24. Hoewel integraal in de aangeboren immuunrespons van het CZS, zijn deze afgescheiden moleculen ook gevonden neuronale oxidatieve stress te vergroten, waardoor het induceren en verergeren neurodegeneratie in zieke toestanden zoals Parkinson en Alzheimer 25-29.
Echter, de mechanismen van microgliale activering in pathologische toestanden niet volledig begrepen. Daarom isolatie van microglia is een krachtig onderzoeksinstrument in deze biologische processen, zoals velen in vivo functies van microglia activatie kan worden samengevat in de cultuur. Verschillende methoden beschikbaar voor het isoleren van microglia, waaronder isolatie via een Percoll gradiënt na enzymatische afbraak van CZS weefsel 30,31. Echter, enzymatische digestie veranderenhet immunofenotype van de cellen door het verminderen celoppervlak antigeen-expressie 32 en resulteert in lagere cel opbrengst per dier dan de hierin beschreven werkwijze. Specifiek, melden wij een gemiddelde microglia opbrengst per pup cortex van 7,5 x 10 5 cellen, terwijl eerder gemeld isolatie methoden uit geheel CNS via een Percoll gradiënt opbrengst 3-5 x 10 5 cellen 30,33,34. De huidige procedure omzeilt het gebruik van de spijsvertering enzymen door het isoleren van microglia op basis van hun lage-aanhankelijkheid eigenschappen, waardoor de microglia immunofenotype en functionaliteit behoud.
In deze studie beschrijven we de isolatie van microgliale cellen uit gemengde gliale kweken afgeleid van neonatale heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) en C57BL / 6 muizen cortex door mechanische agitatie op een roterende schudder, een uitbreiding van eerder gepubliceerd methode 24,35. We maken gebruik van de voormalige muizenstam voor eenvoudige visualisatie van microglia, zoalsDeze muizen brengen GFP onder de controle van de endogene locus CX3CR1 – een monocyt-specifieke promotor 36-38. Deze werkwijze levert zeer zuiver microgliale kweken met een behouden immunofe ex vivo zoals blijkt uit morfologische veranderingen, nucleaire translocatie van p65 en uitscheiding van TNF-α bij provocatie met bacteriële lipopolysaccharide (LPS) of Pam 3 CSK 4, TLR4 en TLR1 / 2 agonisten respectievelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige procedure biedt een effectieve methode voor het isoleren van de corticale microglia van pasgeboren muizen. Deze procedure heeft een dubbel voordeel 1) behoud microglia immunophenotype en functionaliteit, zoals bepaald door fluorescentie beeldvorming, immunocytochemie en ELISA, en 2) zodat microglia rijpen in aanwezigheid van andere gliacellen (astrocyten en oligodentrocytes) vóór isolatie, die belangrijke cel-cel interacties tijdens de gliale cultuur rijpingsduur kan vergemakkelijken. Belangrijk, geïsoleer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
Riferimenti
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscienze. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
