בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine
Summary
מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).
Abstract
בידוד של מיקרוגליה מרקמת מערכת העצבים המרכזית הוא כלי חקירה רב עוצמה המשמש ללימודי ביולוגיה microglial vivo לשעבר. השיטה הנוכחית פרטי הליך לבידודה של מיקרוגליה מקליפת המוח העכברי ילוד על ידי תסיסה מכאנית עם שייקר סיבובי. בידוד מיקרוגליה זה תשואות שיטת מיקרוגליה בקליפת המוח טהורים מאוד כי תערוכת מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים מעידים על מיקרוגליה שקטים בתנאים רגילים, nonpathological in vivo. הליך זה גם משמר את immunophenotype microglial והפונקציונליות ביוכימיים כפי שהודגם על ידי האינדוקציה של שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של למקטע p65 של NF-κB (p65), והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת סימן היכר, גורם-α נמק גידול (TNF-α ), על lipopolysaccharide (LPS) ופאם 3 4 צסק"א (פאם) אתגרים. לכן, הליך הבידוד הנוכחי משמר את immunophenotype של שניהם שקטים וactiמיקרוגליה vated, מתן שיטה ניסיונית של חקירת ביולוגיה מיקרוגליה בתנאי vivo לשעבר.
Introduction
תאי microglial, מקרופאגים המעקב של parenchyma מערכת העצבים המרכזית, מהווים כ 12% מאוכלוסיית התאים הכוללת של המוח של היונקים הבוגרים. מיקרוגליה נגזרים מצק חלמון מיאלואידית מבשר תאים ולהשתנות בצפיפות תאים ומורפולוגיה באזורי cytoarchitectural שונים בתוך מערכת העצבים המרכזית הבוגר 1-5. במוח בוגר בריא, מיקרוגליה הם תאים קטנים, מסועפים או קוטב עם תהליכים עדינים ודינמיים. בניגוד למורפולוגיה מקרופאג היקפי, מיקרוגליה להפגין פנוטיפ במוחות בריאים שעלולות להופיע כחוסר פעילות הסלולר שקט, בפרופיל נמוך, עם זאת, במחקרי הדמיה vivo מראים כי תהליכי microglial דינמי להאריך ולחזור בו כדי לפקח microenvironment שלהם באופן המזכיר את " דגימה ומדידות "6,7.
מיקרוגליה הם מאוד ואופן דיפרנציאלי מגיבים לשינויים סביבתיים וpathophysiological במוח, מיתוגממשגיח למדינות מדינות בדרך כלל נחשבים למנוחה שלהם והופעלו מפעיל, בהתאמה. מתג בהפעלה זו יכול להיות מתווך על ידי מעורבות של קולטני קרום הנכנס זיהוי תבניות (PRRs), כגון קולטנים כמו חיוג (TLRs), אשר מגיבים הלקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן (PAMPs), ליפופרוטאינים כלומר חיידקים ונגיפיים נגזרים , חומצות גרעין, ופחמימות 8-11. בנוסף לPAMPs, PRRs יש גם הוכח כדי לגרום להפעלת microglial נגד מולקולות סטרילי, nonpathogenic המכונים דפוסי סכנה / הקשורים לנזק מולקולרי (damps), המייצגות את הפרעות במערכת העצבים המרכזית הומאוסטזיס, כגון נזק לתאים 12-16. עוסק ברגע, PRRs ליזום תאית מפל איתות כי תוצאות שינויים בביטוי מורפולוגיה של תאים וגני microglial, במיוחד, מיקרוגליה הופעלו להתאים פנוטיפ כמו אמבואידית, translocate מקטע p65 NF-κB (p65) לגרעין התא, וupregulate production והפרשה של ציטוקינים מעודדי דלקת, כגון גורם-α גידול הנמק (TNF-α), β interleukin-1 (IL-1β), יחד עם מיני חמצן תגובתי (ROS) 16-24. אמנם נפרד בתגובה החיסונית המולדת של מערכת העצבים המרכזית, מולקולות המופרשות על אלה יש גם נמצאים להגדיל סטרס חמצונים עצביים, ובכך ישכנעו והחרפת ניוון מוחיים במדינות חולות כמו פרקינסון ואלצהיימר 25-29.
עם זאת, המנגנונים של הפעלת microglial במצבים פתולוגיים שאינם מובן לחלוטין. לכן, בידוד של מיקרוגליה הוא כלי רב עוצמה לחקירת תהליכים ביולוגיים אלה, כפי שרבים בתכונות vivo של הפעלת microglial יכולים להיות סכמו בתרבות. מספר שיטות זמינות לבידוד מיקרוגליה, כולל בידוד באמצעות שיפוע Percoll הבא עיכול אנזימטי של רקמת מערכת העצבים המרכזית 30,31. עם זאת, עיכול אנזימטי יכול לשנותimmunophenotype של התאים על ידי הפחתה על פני קרום תא ביטוי אנטיגן 32, ותוצאות בתשואה נמוכה יותר לכל תא בבעלי חיים מאשר בשיטה שתוארה במסמך זה. באופן ספציפי, אנו מדווחים תשואת מיקרוגליה ממוצעת לקליפת גור של 7.5 x 10 5 תאים, בעוד שדווחו בעבר שיטות בידוד מכל מערכת העצבים המרכזית באמצעות תשואת שיפוע Percoll 3-5 x 10 5 תאים 30,33,34. ההליך הנוכחי עוקף את השימוש באנזימי עיכול על ידי בידוד מיקרוגליה המבוססים על המאפיינים נמוך דבקותם, ובכך לשמר את immunophenotype ופונקציונליות microglial.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים את הבידוד של תאי microglial מתרבויות גליה מעורבות נגזרו מCX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -) הטרוזיגוטיים בילוד, וC57BL / 6 הקורטקס עכברי באמצעות תסיסה מכאנית על שייקר סיבובי, הרחבה של העבר 24,35 שיטה שפורסם. אנו משתמשים בזן העכבר לשעבר להדמיה קלה של מיקרוגליה, כפיעכברים אלה מבטאים GFP תחת שליטתו של מוקד CX3CR1 אנדוגני – אמרגן מונוציטים הספציפיים 36-38. שיטה זו מייצרת תרבויות microglial טהורות מאוד עם השתמרו immunophenotype לשעבר, / 2 אגוניסטים TLR4 וTLR1 vivo כפי שהודגם על ידי שינויים מורפולוגיים, טרנסלוקציה הגרעינית של p65, והפרשה של TNF-α כאשר תיגר עם lipopolysaccharide חיידקים (LPS) או פאם 3 צסק"א 4 , בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך הנוכחי מציע שיטה יעילה לבידודה של מיקרוגליה בקליפת המוח של עכברים בילוד. הליך זה יש יתרון כפול של 1) immunophenotype מיקרוגליה לשמר ופונקציונליות, כפי שנקבע על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, וELISA; ו, 2) המאפשר למיקרוגליה להבשיל בנוכחות של תאים אחרים גליה (האסטרוציטים וoligodentr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
Riferimenti
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscienze. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
