Isolering av Cortical Microglia med Bevarte Immunfenotype og funksjonalitet fra Murine Nyfødte
Summary
En nøkkel til vellykket etterforskning av microglial biologi er bevaring av microglial immunofunction ex vivo under isolasjon fra CNS vev. Isolere mikroglia via roterende risting resultater i svært rene og immunofunctional cellekulturer som vurderes av fluorescerende bildebehandling, immunocytochemistry, og ELISA følgende microglia aktivering med proinflammatoriske stimuli lipopolysakkarid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam).
Abstract
Isolering av mikroglia fra CNS vev er en kraftig undersøkende verktøy som brukes til å studere microglial biologi ex vivo. Den foreliggende fremgangsmåte detaljer av en fremgangsmåte for isolering av mikroglia fra neonatale murine cortices ved mekanisk omrøring med en rotasjonsrister. Dette microglia isolasjon metoden gir svært rene kortikale microglia som viser morfologiske og funksjonelle egenskaper som tyder på hvil mikroglia i normale, nonpathological forhold i vivo. Denne fremgangsmåten bevarer også den microglial immunfenotype og biokjemiske funksjoner som vist ved induksjon av morfologiske endringer, nukleær translokasjon av p65 subenhet av NF-κB (p65) og sekresjon av kjennemerket proinflammatorisk cytokin, tumor nekrose faktor-α (TNF-α ), på lipopolysakkarid (LPS) og Pam 3 CSK 4 (Pam) utfordringer. Derfor bevarer dagens isolasjon prosedyren immunophenotype av både stillestående og aktivigende microglia, som gir en eksperimentell metode for å undersøke microglia biologi i ex vivo forhold.
Introduction
Mikrogliale celler, makrofager overvåking av CNS-parenchyma, utgjør omtrent 12% av den totale cellepopulasjon av den voksne hjernen hos pattedyr. Microglia er utledet fra plommesekken myeloide forløper celler og varierer i celletetthet og morfologi i ulike cytoarchitectural regioner innenfor voksen CNS 1-5. I en frisk voksen hjerne, microglia er små, ramified eller polare celler med fine, dynamiske prosesser. I motsetning til perifer makrofag morfologi, mikroglia demonstrere en sovende, lavprofil fenotype hos friske hjerner som kan vises som cellular inaktivitet, men in vivo imaging studier viser at microglial prosesser dynamisk ut og inn for å overvåke deres mikromiljøet på en måte som minner om " prøvetaking og oppmåling "6,7.
Microglia er høyt og forskjellig lydhør for miljø-og patofysiologiske forandringer i hjernen, byttefra en surveillant til en effektor stats ofte regnet som deres hvile og aktiveres stater, henholdsvis. Denne bryter i aktiveringen kan være mediert ved inngrep av membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs), for eksempel toll-lignende reseptorer (TLR), som reagerer på patogen-assosiert molekyl mønstre (PAMPs), nemlig bakterie-og virus-avledede lipoproteiner , nukleinsyrer, karbohydrater og 8-11. I tillegg til PAMPs, har PRRs også blitt vist å indusere microglial aktivering mot sterilt, ikke-patogeniske molekyler som kalles fare / skadeassosiert molekyl mønstre (demper), som representerer en forstyrrelse i sentralnervesystemet homeostase, slik som cellulær skade 12-16. Når engasjert, PRRs initiere en intracellulær signalering kaskade som resulterer i endringer i microglial cellemorfologi og genuttrykk, spesielt, aktiveres mikroglia tilpasse en amoeboid lignende fenotype, translocate den p65 NF-κB subenhet (p65) til cellekjernen, og oppregulere proDette skjer og sekresjon av proinflammatoriske cytokiner, slik som tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1-β (IL-1β), sammen med reaktive oksygenarter (ROS) 16-24. Selv integrert i den medfødte immunrespons i CNS, har disse utskilte molekylene også blitt funnet å øke neuronal oksidativt stress, og dermed indusere og forverrer neurodegenerering i syke tilstander som Parkinsons og Alzheimers sykdom 25-29.
Imidlertid er mekanismene for microglial aktivering i patologiske tilstander er ikke helt forstått. Derfor, isolering av microglia er en kraftig undersøkende verktøy inn i disse biologiske prosesser, som mange i vivo funksjoner i microglial aktivering kan recapitulated i kultur. Flere metoder er tilgjengelige for å isolere mikroglia, inkludert isolasjon via en Percoll gradient etter enzymatisk fordøyelse av CNS vev 30,31. Imidlertid kan enzymatisk fordøyelse alterimmunfenotypen av cellene ved å redusere celle-overflate-antigen ekspresjon 32, og resulterer i lavere celleproduksjonen per dyr enn den metode som er beskrevet heri. Nærmere bestemt, rapporterer vi en gjennomsnittlig mikroglia avkastning per valp cortex av 7,5 x 10 5 celler, mens tidligere rapportert isolasjon metoder fra hele CNS via en Percoll gradient avkastning 3-5 x 10 5 celler 30,33,34. Den nåværende prosedyren omgår bruk av fordøyelsesenzymer ved å isolere mikroglia basert på deres lav-overholdelse egenskaper, og dermed bevare microglial immunfenotypen og funksjonalitet.
I den foreliggende studien, beskriver vi isolering av microglial celler fra blandede glial kulturer som stammer fra neonatal heterozygote CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP + / -), og C57BL / 6 murine ekser via mekanisk agitasjon på en roterende shaker, en forlengelse av tidligere publisert metode 24,35. Vi utnytter den tidligere mus belastning for enkel visualisering av microglia, somDisse mus uttrykker GFP under kontroll av den endogene Cx3Cr1 locus – en monocytt-spesifikk promoter 36-38. Denne metoden gir svært rene microglial kulturer med en bevart immunophenotype ex vivo som demonstrert av morfologiske endringer, kjernefysisk translokasjon av p65, og sekresjon av TNF-α når utfordret med bakteriell lipopolysakkarid (LPS) eller Pam 3 CSK 4, TLR4 og TLR1 / 2 agonister , henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreliggende fremgangsmåte gir en effektiv metode for isolering av kortikale microglia fra nyfødte mus. Denne prosedyren har en to-fold fordel for en) bevare mikroglia immunophenotype og funksjonalitet, som bestemmes av fluorescerende bildebehandling, immunocytochemistry, og ELISA, og, 2) slik at mikroglia å modne i nærvær av andre gliacellene (astrocytes og oligodentrocytes) før isolering, noe som kan forenkle viktige celle-celle-vekselvirkninger under glial kultur modningsperiode. Viktigere, isolerte celler …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIEHS R01ES014470 (KMZ).
Materials
| Glucose | Sigma | G8270 | Make 20% Stock Solution with MilliQ water; filter sterilize; store at 4 °C; shelf life: 3-6 months. Used to make MCM and MGM. |
| Sodium pyruvate 100 mM (100x) | Hyclone | SH30239.01 | Store at 4 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 units/ml (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C. Used to make MCM, MGM, MM, and DM. |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Fetal Bovine Serum (Defined) | Hyclone | SH30070.03 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Minimum Essential Medium Earle's (MEM) | Cellgro | 15-010-CV | Without L-glutamine. Contains Earle's salts. Used to make MCM, MGM, and DM. |
| Horse Serum | Gibco | 16050 | Filter sterilize; store at -20 °C. Used to make MCM and MGM. |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Cellgro | 21-021-CV | Without calcium and magnesium. Store at 4 °C. Used to make MM. |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-031 | Store at 4 °C. Used to make MM. |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dilactate (DAPI) | Invitrogen | D3571 | Used to stain cell nucleus. |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako | 019-19741 | Used at 1/750 dilution for ICC staining of Iba1. |
| Rabbit anti-NFκB (p65) | Abcam | 7970 | Used at 1/1250 dilution for ICC staining for p65. |
| Alexafluor 594 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11012 | Used at 1/1000 dilution for visualization of antigen:antibody complex in ICC. |
| 10 ml Disposable Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| 50 ml Disposable Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-8 | |
| 15 ml Disposible Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Sterile Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 875713 | 100 mm x 15 mm |
| Scissor: Straight Metzembaum (scissor #1) | Roboz Surgical | RS-6010 | 1; 5 inch; used for removing head |
| Scissor: Vannas (scissor #2) |
Fine Science Tools | 15000-08 | 1; non-angled; 2.5mm cutting edge; used to open scalp |
| Scissor: Student Vannas (scissor #3) | Fine Science Tools | 91501-09 | 1; curved; used to mince brain tissue |
| Forcep: Dumont #7 (forcep #1) |
Fine Science Tools | 91197-00 | 2; used to secure nose and remove cortices |
| Forcep: Dumont #2 (forcep #2) |
Fine Science Tools | 11223-20 | 1; used to remove scalp |
| Forcep: Dumont #3 (forcep #3) |
Fine Science Tools | 11231-30 | 1; used to remove skull |
| Forcep: Dumont #5a (forcep #4) |
Fine Science Tools | 11253-21 | 1; used to remove meninges |
| Table of specific equipment | |||
| Name of Equipment | Name of Company | Catalogue Number | Comments |
| Zoom Stereo Dissection Microscope | Olympus | SZ4060 | Microscope is placed inside Laminar-Horizontal Flow Cabinet |
| Laminar-Horizontal Flow Cabinet | Nuaire | NU-201-330 | |
| Biological Safety Cabinet | Labconco | 3440001 | Class II |
| Water-Jacketed CO2 Incubator | VWR | 97025-836 | Set to 37 °C, 5% CO2 |
| Swing-out buckets | Fisher Scientific | 75006441 | To be used with Swing-out rotor |
| Swing-out Rotor | Fisher Scientific | 75006445 | Max Radius: 19.2 (cm) |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge (clinical centrifuge) |
Fisher Scientific | 75-004-377 | With swing-out rotor |
| AccuSpin Micro 17 microcentrifuge (tabletop microcentrifuge) |
Fisher Scientific | S98645 | With microliter rotor (24 x 1.5/2.0 ml; Cat #: 75003524) |
Riferimenti
- Ranshoff, R. M. P. V. H. Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscienze. 39, 151-170 (1990).
- Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. Development and homeostasis of "resident" myeloid cells: The case of the microglia. Glia. 61, 112-120 (2013).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews. Immunology. , 11-775 (2011).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Hu, S., et al. Cytokine and free radical production by porcine microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).
- Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes. J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).
- Lee, S. J., Lee, S. Toll-like receptors and inflammation in the CNS. Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).
- Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms. Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).
- Halle, A., et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta. Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).
- Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
- Duewell, P., et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals. Nature. 464, 1357-1361 (2010).
- Stewart, C. R., et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4. 11, 155-161 (2010).
- Beraud, D., et al. alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression. Front. Neurosci. 5, 80 (2011).
- Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. Cytotoxicity of microglia.. Glia. 7, 111-118 (1993).
- Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).
- Kim, Y. S., Joh, T. H. Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson’s disease. Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).
- Colton, C., Wilcock, D. M. Assessing activation states in microglia. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).
- Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro. J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).
- Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia. Brain Res. , 1073-1074 (2006).
- Beraud, D., et al. Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson’s Disease Protein alpha-Synuclein. J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).
- Minghetti, L., Levi, G. Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide. Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).
- Hirsch, E. C. Glial cells and Parkinson’s disease. J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).
- Liu, B., et al. Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration. Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).
- Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer’s disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Curr. Med. Chem. 16, 643-651 (2009).
- Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. Neuroinflammation in Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease: are microglia pathogenic in either disorder. Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression. J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).
- Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J. Vis. Exp. , (2011).
- Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation. J. Vis. Exp. , (2012).
- Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity. Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).
- Imai, T., et al. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell. 91, 521-530 (1997).
- Cardona, A. E., et al. Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor. Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).
- Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. Reactive microgliosis. Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
