去耦力学传递线索的影响制备羟基聚丙烯酰胺水凝胶的
Summary
我们提出了一个新的聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基聚丙烯酰胺，它允许直接结合ECM蛋白以最小的成本或专业知识。羟基聚丙烯酰胺的结合水凝胶与微接触印刷有利于学习的蜂窝mechanostransduction独立控制的自然细胞微环境的许多线索。
Abstract
它已经是公认的，很多细胞功能由细胞与它们的细胞外基质（ECM）的环境中的物理化学和机械线索的相互作用调节。真核细胞中不断地感受到通过表面mechanosensors的局部微环境转导细胞外基质的物理变化成生化信号，并将这些信号，实现基因表达的具体变化。有趣的是，ECM可以相互配合物理力学参数来调节细胞的命运。因此，关键是了解机械传导是分离的细胞功能，细胞外基质线索的相对贡献。
在这里，我们提出了一个详细的实验方案，以快速，方便地生成生物相关的水凝胶的机械传导线索体外独立调整。我们化学改性的聚丙烯酰胺水凝胶（聚丙烯酰胺），以克服其内在的非adhes香港专业教育学院通过在聚合过程中掺入羟基官能化的丙烯酰胺单体的特性。我们获得了一种新的聚丙烯酰胺水凝胶，称为羟基聚丙烯酰胺，其允许ECM蛋白的任何所希望的性质的固相化。羟基-聚丙烯酰胺的结合水凝胶与微接触印刷允许独立地控制单细胞的形态，基质硬度的性质和ECM蛋白的密度。我们提供了可以设置在每一个生物实验室体外细胞机械传导过程，研究了一个简单，快捷的方法。我们通过开展对血管内皮细胞表现出细胞外基质的硬度和细胞核之间的机械耦合实验验证了该新型二维平台。
Introduction
局部细胞微环境的许多方面（ 例如 ，刚度，孔隙大小，蛋白质的性质，或细胞的配体密度）提供坐标设置监管线索控制的细 胞过程，如运动性，细胞增殖，分化和基因表达的影响。的胞外环境中的物理化学性质的修改可以由细胞所感知，并导致不同的生理后果，包括细胞分化，迁移和分化的变形。然而，目前还不清楚，细胞如何转化流脑修改成细胞的生化信号。因此，具有重大意义工程师在体外微环境，可再生的细胞与微环境之间的相互作用来研究机械传导途径的控制，这是。为了解决这个问题，我们最近推出了一种新的方法1，称为羟基聚丙烯酰胺水凝胶，方便地生成两毛钱nsional软矩阵，允许独立控制重要的机械传导线索：刚度矩阵，单元的几何形状和约束，蛋白质和细胞配体浓度的本质。
ECM指示经由梯度的细胞过程中的形态发生素（趋化性），胶蛋白（趋触），和硬度（durotaxis）。在过去的几十年中，先进的体外平台已经开发了以分离这些细胞外的线索，以便弄清细胞如何能够翻译生物化学和生物物理特性为生理过程2-5。电子束6，光刻7，光化学固定8，或等离子体辅助的技术9已经开发了直接在微图案化基板的活细胞的生长。虽然这些技术已经取得了重要成果，其中大多数是不允许不同的线索对细胞行为的个人影响力之间的歧视他们需要的技术设备，很少有实验室能负担得起。在这些技术中，微接触印刷（μCP），已经成为一个强大的和可访问的方法创建细胞粘着微型岛屿10。最近，大量努力11-14已开发μCP上的水凝胶具有可调刚性以再现范围广的活组织中观察到刚性的。在这些作品，聚丙烯酰胺酰胺（PAAm）已成为流行15和已经是最常用的聚合物为基础的基质细胞的生物力学分析中的一个。
聚丙烯酰胺的表面通常被官能化的异双功能连接基N-磺基琥珀酰亚胺-6 – [4'-叠氮-2'-nitrophenylamido]（磺基SANPAH）和ECM蛋白通过紫外线活化的磺基 – SANPAH硝基苯的链接到表面叠氮基16。另一种技术包括在耦合肼到已严重氧化蛋白高碘17。海因德和他的同事介绍了图形化水凝胶仿生表面蛋白质和多肽的技术，需要在光聚合的丙烯酰基-链亲和素单体18的存在。最近，曾等人已报道基于聚丙烯酰胺的通过光学石英掩模深UV曝光的新图案化方法19，需要温育活化PA的凝胶用1 -乙基- 3 [3 -二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的水溶液之前添加的蛋白质。尽管这些技术来创建均匀和可再现的蛋白质微图案的能力，其中大多数遭受重大的局限性：长合成过程（ 例如 ，透析，冷冻干燥等），昂贵的化学化合物（ 例如 ，透明质酸，磺基SANPAH）或深紫外线照射。此外，这些技术不允许衬底的刚度，微图案的独立调制几何形状，细胞外基质蛋白的性质，以及细胞 – 配体密度。
考虑到这些限制考虑在内，我们已经开发了一种新的和简单的基于丙烯酰胺的方法，可以让各种软凝胶蛋白质和生物分子的固定化，并允许以破译其对细胞功能的作用，机械传导线索的独立调节。相反，治疗聚丙烯酰胺水凝胶与苛刻的化学化合物，我们引入聚丙烯酰胺聚合过程中的商业丙烯酰胺单体与羟基。这种简单的操作克服了聚丙烯酰胺水凝胶的固有抗粘附性，没有任何其它的技术要求。
羟基基团的存在导致的羟基聚丙烯酰胺水凝胶的形成氢键相互作用的蛋白质和生物分子的亲和性高。与μCP组合，羟基聚丙烯酰胺水凝胶能够迅速生成的二维培养平台与独立控制矩阵的刚性，ECM蛋白的类型，细胞配体密度和密闭的粘附性，其设想是一个强大的平台，学习机械传导。
该协议的目的是提供必要的信息，很容易使羟基聚丙烯酰胺水凝胶在没有材料科学的任何专业知识。最终的目标是提供一种手段，研究人员要求在细胞和组织水平，可能会导致更好的了解所涉及的病理生理机制，机械传导途径的生理有关的问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
许多体外观测在现代细胞生物学已在刚性玻璃盖玻片上，常常涂上一层薄薄的细胞外基质蛋白或含RGD序列的合成肽进行的。然而，这样的基本培养基材不重述ECM的整个物理复杂性，因此不用于研究细胞的机械传导过程提供准确的模型。为了解决这个问题，我们提出了一个简单的替代功能化的二维凝胶与任何需要的量和细胞外基质蛋白的性质。此方法允许的重要机械传导线索，如矩阵刚度，?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
Riferimenti
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