メカノキューの影響をデカップリングするためのヒドロキシのPAAmハイドロゲルの調製
Summary
私たちは、最小限のコストや専門知識を持つECMタンパク質の直接結合を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる新しいポリアクリルアミドハイドロゲルを、提示します。マイクロコンタクトプリント法でヒドロキシ – のPAAmハイドロゲルの組み合わせは、細胞のmechanostransductionを研究するための天然の細胞の微小環境の多くの手がかりを独立して制御を容易にします。
Abstract
現在では、多くの細胞機能は、それらの細胞外マトリックス（ECM）環境の物理化学的および機械的な手がかりを用いた細胞の相互作用によって調節されることが確立されている。真核細胞は、常に、遺伝子発現の特定の変化を達成するために、生化学的シグナルにECMの物理的変化を形質導入し、これらの信号を統合するために、表面mechanosensorsを通じて局所微小環境を感知する。興味深いことに、互いにECM缶のカップルの物理化学的及び機械的パラメータは、細胞の運命を調節する。そのため、メカノを理解する鍵は、細胞機能上のECM手がかりの相対的な寄与を分離することです。
ここでは、迅速かつ容易にin vitroでのメカノ手がかりから独立チューニングのための生物学的に関連するヒドロゲルを生成するために、詳細な実験プロトコルを提示します。私たちは化学的に修飾されたポリアクリルアミドハイドロゲル（PAAmを）は、それらの本質的に非adhesを克服するために重合中にヒドロキシル官能アクリルアミドモノマーを組み込むことによって特性をアイブ。私たちは、ECMタンパク質の任意の所望の性質の固定化を可能にするヒドロキシPAAmを呼ばれる小説のPAAmハイドロゲルを、取得した。マイクロコンタクトプリンティング、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの組み合わせは、独立して、単一細胞の形態、マトリックス剛性、性質およびECMタンパク質の濃度を制御することを可能にする。私たちは、in vitro細胞メカノ過程で勉強するすべての生物学の実験室で設定することができ、簡単で迅速な方法を提供する。今後は、ECMの剛性と核との間の機械的結合を実証する内皮細胞上の実験を行うことにより、この新規二次元のプラットフォームを検証します。
Introduction
局所的な細胞微小環境（ 例えば 、剛性、細孔径、タンパク質の性質、または細胞リガンド密度）の多くの局面は、運動性、細胞増殖、分化、および遺伝子発現のような細胞プロセスを制御する調節手がかりの座標セットを提供する。細胞外環境の物理化学的特性の改変は、細胞によって認識されると細胞の分極の変形、移動、および分化を含む、異なる生理学的結果を引き起こすことができる。これは、細胞が細胞の生化学的シグナルにECMの変更を変換する方法が、依然として不明である。したがって、主要な重要性メカノ経路を研究するための細胞とそれらの微小環境との間の相互作用を再現できるin vitroでの微小環境を制御操作することである。この問題に対処するために、容易に二ダイムを生成するために、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルと呼ばれる新規な方法1を 、最近導入されている独立して重要なメカノキューを制御することが可能とnsionalソフト行列：行列のこわばり、セルの形状と閉じ込め、タンパク質の性質および細胞リガンド密度。
ECMはモルフォゲン（走化性）における勾配、接着性タンパク質（走触性）、および剛性（durotaxis）を介して細胞プロセスを指示します。過去数十年にわたり、in vitroでのプラットフォームの高度は、細胞が生理学的プロセス2-5に生化学的および生物物理学的特徴を翻訳することができますどのように引き出すために、これらの細胞外の合図を分離するために開発されてきた。電子ビーム6、フォトリソグラフィー7、光化学固定化8、またはプラズマ支援技法9は、マイクロパターン化基体上の生きている細胞の増殖を導くために開発されてきた。これらの技術は重要な結果が得られているが、それらのほとんどが細胞挙動に対する異なる手がかりの個別の影響の間の識別を許可しない彼らはいくつかの研究室は余裕ができるという技術的設備を必要とします。これらの技術の中でも、マイクロコンタクトプリント（μCP）は、細胞接着性ミクロの島10を作成するために、堅牢でアクセス可能な方法として浮上している。より最近では、多大な努力11-14は、生体組織において観察された剛性の広い範囲を再現するために調整可能な剛性を有するヒドロゲルでμCPの開発がなされてきた。これらの作品の中では、ポリアクリルアミド（PAAmを） を15普及し、すでに細胞バイオメカニクスアッセイのための最も一般的に使用されるポリマーベースのマトリックスの1つになっています。
PAAmを表面は一般的にN-スルホスクシンイミジル-6 – [4'-アジド-2'-nitrophenylamido]（スルホ-SANPAH）およびECMタンパク質は、スルホ-SANPAHニトロフェニルのUV活性化により表面に結合されているヘテロ二官能性架橋剤で官能化されアジド基16。別の技術は深刻な酸化されたタンパク質に結合ヒドラジンから成るヨウ素酸17。ハインドらはアクロイル-ストレプトアビジンモノマー18の存在下での光重合を必要とするタンパク質およびペプチドと生体模倣ハイドロゲルの表面をパターン化するための技術を導入した。より最近では、ツェンらは、1 -エチル-3 – [3 -ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）で活性化PAゲルをインキュベートするために必要な光学石英マスクを通してのPAAmのディープUV露光に基づいて新しい微細方法19を報告しているタンパク質を追加する前とN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）水溶液。長い合成方法（ 例えば 、透析、凍結乾燥など）、高価な化学化合物（ 例えば 、ヒアルロン酸、スルホ-SANPAH）または深UV：均質で再現性のあるタンパク質の微細パターンを作成するためにこれらの技術の能力にもかかわらず、それらのほとんどは、主要な制限を被る照射。また、これらの技術は、基板の剛性の独立した変調、微細パターンを許可しないジオメトリ、ECMタンパク質の性質、および細胞 – リガンド密度。
考慮にこれらの制限を考えると、私たちはソフトハイドロゲル上のタンパク質および生体分子の多様性の固定化を可能にし、細胞機能に及ぼす役割を解読するために、メカノキューとは独立してチューニングを可能にする新規かつシンプルなアクリルアミドベースのアプローチを開発しました。代わりに過酷な化学的化合物とのPAAmヒドロゲルの治療は、PAAmを重合中のヒドロキシル基を有する市販のアクリルアミドモノマーを導入する。この単純な操作は、他の技術的な要件なしのPAAmハイドロゲルの固有抗接着性を克服する。
水酸基の存在は水素結合相互作用を形成するタンパク質および生体分子のためのヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルの高い親和性をもたらす。 μCPと組み合わせて、ヒドロキシ-PAAmをヒドロゲルは、独立した制御を備えた二次元培養プラットフォームの迅速な生成を可能にするメカノを研究するための強力なプラットフォームであると想定されているマトリックスの剛性、ECMタンパク質の種類、細胞リガンド密度と閉じ込められた接着性、オン。
このプロトコルの目的は、容易に材料科学の専門知識を持たない任意のヒドロキシPAAmをヒドロゲルを作製するために必要な情報を提供することにある。研究者は病態生理学的メカニズムに関与してメカノ経路のより良い理解につながる可能性が細胞および組織レベルでの生理学的に関連する質問をするための究極の目標は、手段を提供することである。
Protocol
Representative Results
Discussion
現代の細胞生物学のin vitroでの観察の多くは、多くの場合、ECMタンパク質またはRGD配列を含む合成ペプチドの薄層で被覆された硬質ガラス製カバースリップ上で行われている。しかし、そのような基本的な培養基質は、細胞のメカノプロセスを研究するための正確なモデルを提供しないので、ECMの全体の物理化学の複雑さを再現していません。この問題に取り組むために、任意の所望?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Belgian National Foundation for Scientific Research (F.R.S.-FNRS) through “MIS Confocal Microscopy”, “Crédit aux Chercheurs” grants and the “Nanomotility FRFC project” (no. 2.4622.11). T.G. doctoral fellowship is supported by the Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). The authors gratefully acknowledge Sylvain Desprez for mechanical characterization and Géraldine Circelli for confocal imaging.
Materials
| UV/Ozone Photoreactor | Ultra-Violet Products | Model PR-100 | |
| Rocking plate | IKAcWerke | Model KS 130 Basic | |
| Vortexer | Scientific Industries | Model Vortex Genie2 | |
| Vacuum degassing chamber | Applied Vacuum Engineering | DP- 8-KIT | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Stainless steel forceps with fine tip | Sigma-Aldrich | Z225304-1EA | |
| Dressing tissue forceps | Sigma-Aldrich | F4392-1EA | |
| Petri dishes in polystyrene | Sigma-Aldrich | P5731-500EA | |
| Aluminium foil, thickness 0.5 mm | Sigma-Aldrich | 266574-3.4G | |
| Isopore membrane filter (0,2 µm pore size) | Millipore | GTTP Filter code | |
| Round glass coverslip (22 mm diameter) | Neuvitro | GG-22 | |
| Round glass coverslip (25 mm diameter) | Neuvitro | GG-25 | |
| Variable volume micropipette | Sigma-Aldrich | Z114820 | |
| Protein microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | |
| Scalpel handles | Sigma-Aldrich | S2896-1EA | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2771-100EA | |
| Cell culture flasks (75 cm2) | Sigma-Aldrich | CLS430641 | |
| Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel) | Sigma-Aldrich | Z613983-1EA | |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Acrylamide (powder) | Sigma-Aldrich | A3553 | |
| N,N’-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| N-Hydroxyethylacrylamide | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Amonium PerSulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| 3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate | Sigma-Aldrich | 1805 | |
| Human Plasma Fibronectin | Millipore | FC010 | |
| Laminin from EHS | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Sodium hydroxyde | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Double-distilled water (ddH2O) | |||
| Endothelial cell growth medium | Cells Applications | 211K-500 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) | Invitrogen | C-003-5C | |
| Accutase | PAA laboratories | L11-007 | |
| HEPES buffer solution 1M in H20 | Sigma-Aldrich | 83264-500ML-F | |
| Antibiotics-antimycotics | PAA laboratories | P11-002 | |
| Phosphate Buffer Saline solution | PAA laboratories | H15-002 | |
| Alexa Fluor 488 Phaloidin | Molecular Probes | A12379 | |
| Anti-vinculin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine | Molecular Probes | T-2762 | |
| Anti-Fibronectin | Sigma-Aldrich | F3648 | |
| (rabbit) | |||
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 41469 | |
| Anti-Laminin antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| (rabbit) | |||
| Anti-rabbit IgG-FITC | Sigma-Aldrich | F7512 | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T3924-100ML | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 459844-2.5L |
Riferimenti
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