Crónica a largo plazo<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Infección de las vías respiratorias en los ratones
Summary
Se describe el método de agar-perlas para establecer la infección de las vías respiratorias persistente a largo plazo crónica de Pseudomonas aeruginosa en el modelo de ratón.
Abstract
Un modelo de ratón de la infección crónica de la vía aérea es un activo clave en la fibrosis quística (FQ) de investigación, aunque hay una serie de preocupaciones con respecto al modelo en sí. Fases tempranas de la inflamación y la infección han sido ampliamente estudiados utilizando el modelo de agar-perlas de ratón Pseudomonas aeruginosa, mientras que sólo pocos informes se han centrado en la infección crónica a largo plazo in vivo. El reto principal para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica que las células bacterianas se borran progresivamente por el anfitrión.
En este trabajo se presenta un método para la obtención de la infección crónica eficiente a largo plazo en ratones. Este método se basa en la incorporación de la P. cepas clínicas aeruginosa en el agar-perlas in vitro, seguido de la instilación intratraqueal en ratones C57Bl/6NCrl. Infección pulmonar bilateral se asocia a sevrales medibles de lectura-outs, incluyendo la pérdida de peso, la mortalidad, la infección crónica, y la respuesta inflamatoria. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 ya que resultó en una mortalidad relativamente baja, las lesiones más graves y mayor infección crónica. P. aeruginosa colonización puede persistir en el pulmón durante más de tres meses. Patología pulmonar murino se asemeja a la de los pacientes con FQ con enfermedad pulmonar crónica avanzada.
Este modelo murino imita más estrechamente el curso de la enfermedad humana y puede ser utilizado tanto para los estudios sobre la patogénesis y para la evaluación de nuevas terapias.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética causada por mutaciones en el quística regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis gen (CFTR). Este gen codifica para un canal de cloruro expresado en la membrana de la mayoría de las células epiteliales. Bronquiectasia, tapones mucosos y parénquima destrucción causada principalmente por infecciones por Pseudomonas aeruginosa conducen progresivamente a la enfermedad pulmonar grave y la mortalidad en la mayoría de los pacientes con FQ 1. Patogénesis CF entendimiento y el desarrollo de nuevas terapias se basan en el modelo animal con rasgos característicos de la CF. Varios ratones, genéticamente modificados para el gen CFTR, se han generado, pero las limitaciones en la capacidad de estas especies de recapitular la enfermedad de pulmón con FQ como-y varias otras anomalías de órganos observados en los pacientes con FQ han sido ampliamente documentado 2.
Desarrollo de la infección es uno de los principales retos en modelo animal CF. Las cl literaturatemprano sugiere que una infección crónica que dura más de un mes sólo puede lograrse si los ratones se inocularon con bacterias incrustadas en un agente de inmovilización tales como agar, agarosa, alginato o algas 3-5. Estos agentes de inmovilización proporcionan las condiciones microaeróbica / anaerobias que permiten que las bacterias crezcan en forma de microcolonias, al igual que el crecimiento de la mucosa de los pacientes con FQ 6. Este modelo de la infección crónica conduce a la persistencia de la bacteria en los pulmones y causar inflamación de las vías respiratorias y daños 7. Sin embargo, dependiendo del método utilizado, la cepa bacteriana y la dosis inoculada en los pulmones, el porcentaje de los ratones infectados crónicos y la carga bacteriana recuperado en los pulmones en diferentes puntos de tiempo pueden diferir considerablemente. En particular, el principal desafío para la infección crónica a largo plazo sigue siendo la baja carga bacteriana de P. aeruginosa y el bajo porcentaje de semana ratones infectados después de la exposición, lo que indica thacélulas bacterianas camisetas se borran progresivamente por el anfitrión. Mediante la selección de la P. aeruginosa RP73 cepa clínica de una colección de cepas CF 8 recabamos baja mortalidad, las lesiones más graves, y un alto porcentaje de infección crónica con una carga bacteriana estable hasta un mes en ratones C57Bl/6NCrl.
En este trabajo se detalla la metodología para incluir P. aeruginosa en las perlas de agar; hemos ratones infectados por instilación intratraqueal, se mide la carga bacteriana y citoquinas en los pulmones, se recogió el líquido de BAL y realizado el examen histológico. En general, este protocolo ayudará a los investigadores para abordar cuestiones de importancia fundamental en la patogénesis de 8,9 y probando nuevas terapias contra P. aeruginosa infección crónica 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en la P. preparación aeruginosa-cuentas y el desafío del ratón se presentan a continuación.
La cepa de P. aeruginosa se utiliza para el desafío ratones es crítico. La mortalidad, la infección crónica o aclaramiento pueden diferir significativamente dependiendo de la cepa bacteriana utilizada para el desafío. El P. Se prefirió aeruginosa RP73 cepa clínica sobre la cepa de laboratorio de referencia PAO1 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación en el laboratorio de Bragonzi ha sido financiado por la Fundación de Fibrosis Quística italiana (CFaCore) y UE-F7-2009-223670. Parte de este trabajo se llevó a cabo en ALAMBIQUE, un laboratorio de microscopía avanzada, y la histopatología del ratón se llevó a cabo en la Unidad de Anatomía Patológica (Instituto Científico San Raffaele).
Materials
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml syringe 25 G 5/8'' 0.5 x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22GA 0.9 x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps – 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% neutral buffered formalin | Bio-optica | 05-01005Q | |
| Harris haematoxylin non Papanicolau | Bio-optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-optica | 05-M11007 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366931(great) | |
| 2366925(small) | |||
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 |
Riferimenti
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