Isolering og dyrkning af endotelceller fra embryonale forebrain
Summary
Denne video viser en nem og pålidelig strategi for forberedelsen af rene kulturer af endotelceller fra den embryonale forhjernen indenfor 10-12 dage og vil være nyttigt for forskning fokuseret på mange aspekter af cerebral angiogenese.
Abstract
Embryonale hjerne endotelceller kan tjene som et vigtigt redskab i studiet af angiogenese og neurovaskulære udvikling og samspil. De to vaskulære netværk af embryonale forhjerne, pial og periventricular, er rumligt karakteristisk og har forskellige oprindelser og vækstmønstre. Endotelceller fra pial og periventrikulære vaskulære netværk har unikke genekspressionsprofiler og funktioner. Her præsenterer vi en trin-for-trin-protokollen for isolation, kulturforskelle, og verifikation af rene populationer af endotelceller fra periventrikulær vaskulære netværk (PVECs) i embryonale forhjerne (telencephalon). I denne fremgangsmåde er telencephalon mangler pial membran opnået fra embryonisk dag 15 mus hakket fordøjet med collagenase / dispase og dispergeres mekanisk til en enkelt cellesuspension. PVECs renses fra celle suspension ved hjælp af positiv selektion med anti-CD-31/PECAM-1 antistof konjugeret til mikroperler ved hjælp af et stærkt magnetiskseparationsmetode. Oprensede celler er dyrket på collagen 1 coatede dyrkningsskåle i endotel celledyrkningsmedium indtil de bliver sammenflydende og yderligere subdyrket. PVECs opnået med denne protokol udstille brosten og spindel formet fænotyper, som visualiseres ved fasekontrast lysmikroskopi og fluorescens mikroskopi. Renheden af pVec kulturer blev etableret med endotelcellespecifikke markører. I vores hænder, denne metode pålideligt og konsekvent giver rene populationer af PVECs. Denne protokol vil gavne undersøgelser med henblik på at opnå mekanistiske indblik i forebrain angiogenese, forståelse pVec interaktioner, og cross-samtaler med neuronale celletyper og rummer et enormt potentiale for terapeutisk angiogenese.
Introduction
Angiogenese, neurogenese og neuronal migration er kritiske hændelser i det centrale nervesystem (CNS) udvikling, reparation og regeneration. Flere elegante undersøgelser har vist, at endotelceller stimulere neuronal proliferation og vice versa via frigivelse af opløselige faktorer, og ved direkte kontakt. Vi fandt det mærkeligt, at i de fleste af disse undersøgelser 1-3, mens neuronal progenitorer / neurale stamceller er isoleret fra embryonale hjerne, er de samdyrket med endotelceller fra den voksne hjerne, andre voksne vævskilder eller endotheliale cellelinier. Dette kan delvis skyldes de tekniske vanskeligheder, der er forbundet med isolering og dyrkning af rene populationer af endotelceller fra embryonale hjerne. Men angiogenese, neurogenese, og neuronal migration er samtidige begivenheder i størrelsesordener mere robust i embryonale hjernen end i den normale voksne hjerne. Periventricular vaskulære netværk af embryonic forhjerne (telencephalon) stammer fra et skib beliggende inden basalganglierne primordium og udvikler sig i form af en ordentlig gradient fra ventrale til dorsal telencephalon af embryonal dag 11 (E11) 4,5. Denne plexus af fartøjer af periventrikulær vaskulære netværk adskiller sig fra pial fartøjer baseret på oprindelse, anatomiske placering, vækstmønstre og udviklingsmæssige regulering 4,5. Retningen af udbredelsen af periventricular angiogenese gradient matcher telencephalic tværgående neurogenetic gradient. Inden telencephalon, periventricular angiogenese gradient og gradienten af GABA-neuroner migrerer tangentielt overlapper rumligt samt 6. Med hensyn til timing, angiogenese gradient er forud for den neurogenetic gradient og GABA neuron gradient med omkring en dag. Således periventrikulære endotelceller er rumligt og tidsligt godt positioneret til at levere kritiske stikord til at understøtte telencephalic neurogenesis ogneuronal migration 4,6. Derfor, brug af embryonale periventrikulære endotelceller i cokultur eksperimenter med neuronale forfædre og / eller neuroner ville give en mere gunstig model til at studere neurovaskulære interaktioner og udvikle nye muligheder for behandling af neurodegenerativ sygdom eller iskæmisk / traumatisk hjerneskade.
Vi understreger vigtigheden af at fjerne pial membran, ikke kun for at begrænse forurening epitelcelle men også at adskille pial endotelceller, som er molekylært og funktionelt adskilt fra endotelceller periventricular vaskulære netværk 4,6 (betegnes PVECs at skelne fra pial ECS), . Her beskriver vi den metode, som vi rutinemæssigt bruger i vores laboratorium for at opnå en rig og ren udbytte af PVECs. Disse endotelceller er fremstillet ud fra embryonale forebrains isoleret fra en enkelt timed-gravide mus. De kan udvides, videredyrkes, og frosset ned med succes til fremtidig brug.
Protocol
Representative Results
Discussion
PVec er er mere fysiologisk relevant end voksne hjerne endotelceller og ECS fra andre væv kilder til undersøgelser, der fokuserer på neurovaskulære interaktioner og også have terapeutisk potentiale. For pVec forberedelse, er det afgørende begyndelse med dissektion at arbejde hurtigt for at opnå en god rentabilitet, idet døde celler kan binde uspecifikt til CD31 mikroperler. Desuden, hvis en enkelt cellesuspension ikke opnås før den magnetiske mærkning trin, vil dette resultere i fejlfinding, da cellekly…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en Nationale Alliance for forskning i Skizofreni og Depression (NARSAD) Young Investigator Award og National Institutes of Health indrømmer R01NS073635 til AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
Riferimenti
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
