Tissue Engineering: Bygging av en Flercellede 3D Stillas for levering av Lagdelte Cell Sheets

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Mange vev, slik som den voksne menneskehjerter, er ikke i stand til i tilstrekkelig grad å regenerere etter skade. ^2,3 strategier i vevsteknologi foreslå innovasjoner å hjelpe kroppen i utvinning og reparasjon. For eksempel kan TE tilnærminger være i stand til å dempe hjerte ombygging etter myokardialt infarkt (MI) og eventuelt øke totalt hjerte-funksjonen til en nær normal pre-MI-nivå. ^Fire Som med en hvilken som helst funksjonelt vev, vellykket regenerering av hjertevev involverer levering av riktig flere celletyper med miljø signaler favoriserer integrering og overlevelse av implantert celle / vev pode. Utviklet vev bør rette flere parametere inkludert: løselig signaler, celle-til-celle interaksjoner, og matriksmaterialer evaluert levering kjøretøy, deres effekter på celleoverlevelse, materialstyrke, og tilrettelegging for celle-til-vev organisasjon. Studier som benytter direkte innsprøyting av pode celler bare ignorere disse viktige elementer. ^2,5,6En vev design som kombinerer disse ingrediensene har ennå ikke utviklet. Her presenterer vi et eksempel på integrerte design med lagdeling av celle mønstrede ark med to forskjellige typer av biologisk avledede materialer som inneholder målorganet celletype og endoteliale celler for å øke nytt fartøy formasjonen i "tissue". Selv om disse studiene fokuserer på generering av hjerte-lignende vev, kan dette vevet design kan brukes til mange andre enn hjerte med minimalistisk design og materialendringer organer, og er ment å være en off-the-sokkel produkt for regenerativ behandling. Protokollen inneholder fem detaljert fremgangsmåte. En temperaturfølsom poly (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) blir brukt til å belegge Vevdyrkningsskåler. Deretter vev bestemt dyrkes cellene på overflaten av de belagte plater / micropattern overflater for å danne celle ark med sterke side adhesjon. For det tredje er en basismatrise opprettet for vevet ved å kombinere porøse matrise med neovaskulær permissive hydrogeler og endotelceller. Til slutt blir de celle arkene løftet fra pNIPAAM belagte retter og overført til basiselementet, slik at den komplette konstruksjonen.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1. Opprettelse av pNIPAAM-belagte plater Oppløs 2,6 g pNIPAAM i 2 ml av en 60% toluen / heksan 40% løsning. Varm blandingen til 60 ° C i 10 min omrørt inntil pNIPAAM er oppløst. Skjær filter papir i en 60 mm diameter sirkel og sted papir i Buchner trakt. Filtrer løsningen gjennom Buchner trakt inn i den pre-veid glassbeholder (ikke bruk av plast, som heksan smelter plast). Plasser begerglass og innholdet inn i en vakuumklokke (24 psi) O / N (16 timer). Merk: Innt…

Representative Results

Den flytdiagram (figur 1) viser den generelle metode for å gjøre den flerlags plasteret. Celle ark er løsrevet fra pNIPAAM behandlede plate ved å slippe temperaturen ble holdt under 32 ° C. Da cellefolie er plassert på toppen av den tverrbundne hydrogel inneholdende endotelceller sådd inn i den underliggende fibrøs matriks (figur 1). De forbehandlede termo-følsomme plater kan også brukes for å lage celle ark. Spesielle topologiske flater brukes til spesifikt mønster (dvs…

Discussion

De kritiske trinnene i protokollen omfatter: å belegge plateoverflater med thermoresponsive polymer og manipulere celle ark etter avkjøling platene. Fordi forskjellige celler oppviser forskjellige fysikalske egenskaper, som adhesivity, løfte tid bør være optimalisert for hver annen celletype. Den andre, og særlig utfordrende komponent i denne protokollen, sentre på manipulering av cellefolien, en kritisk del av fremgangsmåter for vev sammenstillingen. Den enkeltcellelaget i cellen arket er ganske skjør og kan r…

Materials

Table of Reagents:
Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime	————
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Table of Specific Equipment:
Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light.	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42