Engenharia de Tecidos: Construção de um multicelular 3D andaime para a entrega de camadas celulares Sheets

Summary

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Abstract

Muitos tecidos, como os corações humanos adultos, são incapazes de se regenerar adequadamente após a lesão. ^2,3 Estratégias em engenharia de tecidos propor inovações para ajudar o corpo a recuperação e reparação. Por exemplo, as abordagens TE pode ser capaz de atenuar a remodelação cardíaca após infarto do miocárdio (IM) e, possivelmente, aumentar a função cardíaca total a um próximo nível pré-MI normal. ⁴ Tal como acontece com qualquer tecido funcional, regeneração bem sucedida do tecido cardíaco envolve a entrega dos vários tipos de células com sinais ambientais que favoreçam a integração e sobrevivência do enxerto de células / tecido implantado. Tecidos artificiais devem abordar vários parâmetros, incluindo: sinais solúveis, interações célula-célula, e materiais de matriz avaliados como veículos de entrega, os seus efeitos sobre a sobrevivência da célula, resistência do material, e facilitação de organização célula-tecido. Estudos empregando a injeção direta de células do enxerto apenas ignorar esses elementos essenciais. ^2,5,6Um projeto de tecidos combinando esses ingredientes ainda tem de ser desenvolvido. Aqui, apresentamos um exemplo de projetos integrados que utilizam camadas de folhas de células padronizadas com dois tipos distintos de materiais biológicos derivados contendo o tipo de célula para órgãos-alvo e células endoteliais para aumentar a formação de novos vasos no "tecido". Embora esses estudos concentram-se na geração de tecido cardíaco semelhante, este projeto tecido pode ser aplicado a muitos outros do que o coração com design e material alterações mínimas órgãos, e é destinado a ser um produto off-the-shelf para terapias regenerativas. O protocolo contém cinco etapas detalhadas. Uma temperatura de poli sensível (N -isopropylacrylamide) (PNIPAAm) é usado para placas de cultura de tecidos revestimento. Em seguida, as células são cultivadas de tecido específico sobre a superfície das placas revestidas / superfícies micropattern para formar camadas de células com aderências laterais fortes. Em terceiro lugar, uma matriz de base, é criado para o tecido através da combinação de matriz porosa com Permissi neovascularve hidrogéis e células endoteliais. Finalmente, as folhas de células são levantados a partir dos pratos PNIPAAm revestidos e transferido para o elemento de base, fazendo com que a construção completa.

Introduction

Injection of cells and/or single materials alone has shown variable success in other organ systems and limited success in cardiac regeneration.^5,7-12 Currently, stem cell-derived cells are delivered to damaged tissue using a variety of delivery methods including: direct cell injection into tissue and perfusion into the blood supply.^13-17 Others have implanted cells alone, materials alone and/or in combination with material carriers to help regenerate damaged organs.^18-21 This design combines multiple strategies that provide material strength, patterning in multiple materials and multiple cell types.

Specifically, the base acellularized fibrous matrix provides the foundational physical strength to the construct, making it suitable for suturing in into the patient, if necessary. The void spaces in the base matrix are filled with endothelial cells in a neovascular permissive hydrogel²² for rapidly establishing vascularization of the implanted construct. This composite is then integrated with pre-patterned cell sheets that allow enhanced cell-to-cell communication, more closely mimic the native tissue.^1,23-25 The overall production process for the layered cellular patch is outlined by the flowchart in Figure 1.

Protocol

1 Criação de placas PNIPAAm revestidas Dissolve-se o 2,6 g de PNIPAAm em 2 ml de uma solução de hexano a 60% de tolueno / 40%. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos agitou-se, até que a PNIPAAm é dissolvido. Cortar papel de filtro para um círculo de diâmetro 60 mm e coloque o papel no funil de Buchner. Filtrar a solução através de Buchner Funil para a pré-pesado copo de vidro (não use plástico, como o hexano vai derreter plásticos). Colocar a pro…

Representative Results

O diagrama de fluxo (Figura 1) mostra o método geral para fazer o penso multicamadas. Folhas de células são separadas da placa tratada PNIPAAm por baixar a temperatura abaixo de 32 ° C. Em seguida, a camada de células é colocada em cima do hidrogel reticulado contendo as células endoteliais semeadas na matriz fibrosa subjacente (Figura 1). As placas pré-tratados termossensíveis, também podem ser utilizados para criar as camadas de células. Superfícies topológicas especiais …

Discussion

Os passos críticos no protocolo incluem: revestimento das superfícies das placas com o polímero thermoresponsive e manipular as folhas de células após o arrefecimento das placas. Como as células diferentes apresentam diferentes propriedades físicas, como adesividade, o tempo de elevação deve ser otimizado para cada tipo de célula diferente. O segundo, e mais importante desafio componente deste protocolo, centra-se na manipulação da camada de células, um aspecto crítico dos métodos para a montagem do tecid…

Materials

Table of Reagents:
Reagent	Company	Catalogue number	Comments
Calcein-AM	Invitrogen	C3099	Cell tracker / live dye
Lysotracker Red	Invitrogen	L7528	Cell tracker
Neutral Red	Sigma	N7005	Visible Cell dye
pNIPAAM	Sigma Aldrich	412780250	Poly(N-isopropylacrylamide)
Toluene	Sigma Aldrich	244511-1L
Hexane	Sigma Aldrich	296090-1L
RAOSMC	Lonza	R-ASM-580	Rat Aortic Smooth Muscle Cells
SmGM2	Lonza	CC-4149	Smooth Muscle Media
HUVEC	Invitrogen	C-003-5C	Human Venous Endothelial Cells
HyStem	Glycosan/Biotime	————
Isopropyl alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
Trypsin	Corning Cellgro	25-053-C1
PBS	Gibco	14287-072
FBS	Gibco	16140-071
Table of Specific Equipment:
Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Filter paper	Ahlstrom	6310-0900
Buchner Funnel	Sigma Aldrich	Z247308
UpCell Plates	Nunc	2014-11
UV light.	Jelight Company	UVO Cleaner Model No.42