त्वचा में एकल तंत्रिका अंत के vivo दो photon माइक्रोस्कोपी में
Summary
गतिशील अनुदैर्ध्य इमेजिंग और रिपोर्टर ट्रांसजेनिक चूहों में तंत्रिका अंत के चयनात्मक लेजर घाव के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.
Abstract
त्वचा में तंत्रिका अंत ऐसे न्यूरोपैथिक दर्द 2 जैसे 1 संवेदन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग प्रक्रियाओं में शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल रहे हैं. उनके पास से सतह स्थिति बरकरार पशु रहने में त्वचा तंत्रिका अंत की सूक्ष्म इमेजिंग की सुविधा. Multiphoton माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, यह त्वचा के ऊतकों की तेज रोशनी बिखरने की समस्या पर काबू पाने के ठीक छवियों को प्राप्त करने के लिए संभव है. (परिधि संवेदी न्यूरॉन्स सहित) न्यूरॉन्स में तेरा-1 प्रमोटर के नियंत्रण में EYFP व्यक्त कि रिपोर्टर ट्रांसजेनिक चूहों के ऊपर कई महीनों के लिए या यहां तक कि जीवन लंबे समय की विस्तारित अवधि से अधिक व्यक्ति तंत्रिका अंत के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. इसके अलावा, इमेजिंग के लिए के रूप में ही femtosecond लेजर का उपयोग कर, यह तंत्रिका फाइबर पुनर्गठन की पढ़ाई के लिए तंत्रिका तंतुओं के अत्यधिक चयनात्मक घावों का उत्पादन संभव है. यहाँ, हम vivo इमेजिंग में अनुदैर्ध्य multiphoton के लिए एक सरल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल वर्तमान औरमाउस त्वचा तंत्रिका अंत पर लेजर आधारित microsurgery.
Introduction
त्वचीय तंत्रिका अंत अलग pathophysiological राज्यों तहत dynamical परिवर्तन से गुजरना. तंत्रिका तंतुओं परिधीय न्यूरोपैथी 2 या मॉर्टन न्यूरोमा 3 के रूप में इस तरह के रोगों के पाठ्यक्रम में अध: पतन और उत्थान या पुनर्गठन की प्रक्रिया के माध्यम से जा सकते हैं. दर्दनाक चोट के बाद, त्वचा में तंत्रिका अंत गतिशीलता का एक महत्वपूर्ण हिस्सा क्षतिग्रस्त क्षेत्र के reinnervation है. हालांकि, तंत्रिका अंत की जांच के लिए सामान्य दृष्टिकोण चल रही प्रक्रियाओं 4 पर वास्तविक समय की जानकारी का अभाव है कि पूर्व vivo ऊतकीय सेक्शनिंग है. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट मार्कर का उपयोग करना, यह इस प्रकार संरचनात्मक परिवर्तन पर अमीर और काफी अधिक प्रासंगिक जानकारी प्राप्त करने, जीवित पशुओं की त्वचा में तंत्रिका अंत ट्रैक करने के लिए संभव है. त्वचीय तंत्रिका अंत की जांच पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी, हालांकि, त्वचा के ऊतकों की तेज रोशनी बिखरने जोरदार गुणवत्ता को नजरअंदाज का उपयोग संभव हैडेटा के 5 हासिल कर ली. Multiphoton माइक्रोस्कोपी के कारण ही उद्देश्य के केन्द्र बिन्दु से प्रतिदीप्ति के उत्सर्जन में जिसके परिणामस्वरूप उत्तेजना प्रकाश फोटॉनों की ऊर्जा के गैर रेखीय योग करने के लिए दृढ़ता से बिखरने के ऊतकों में उच्च संकल्प छवियों के अधिग्रहण की अनुमति देता है. इस आशय की त्वचा के ऊतकों 6 में मापन के लिए एक मजबूत पैठ गहराई में वृद्धि हुई है और संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के लिए जाता है. इमेजिंग के लिए के रूप में ही लेसर का उपयोग कर, यह तंत्रिका तंतुओं 7 के चुनिंदा विच्छेदन का उत्पादन संभव है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम चयनात्मक लेजर घाव व्यावसायिक रूप से उपलब्ध multiphoton खुर्दबीन प्रणाली का उपयोग के साथ संयुक्त संवाददाता ट्रांसजेनिक चूहों में vivo में त्वचा संबंधी तंत्रिका अंत के अनुदैर्ध्य इमेजिंग की पद्धति दिखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो प्रोटोकॉल में हम एक तंत्रिका अंत की गैर इनवेसिव अनुदैर्ध्य दो photon इमेजिंग के लिए विधि प्रदर्शित करता है.
त्वचा innervations की गतिशीलता सोरायसिस और परिधीय न्यूरोपैथी 2, के रूप में इस तर?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों वित्तीय सहायता के लिए तकनीकी सहायता, CIMO फाउंडेशन और FGSN लिए Neurotar लिमिटेड को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Riferimenti
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
