In Vivo Two-foton mikroskopi av enstaka nervändar i huden

Summary

Protokollet för dynamisk longitudinell avbildning och selektiv laser skada i nervändar i reporter transgena möss presenteras.

Abstract

Nervändar i huden är involverade i fysiologiska processer såsom att avkänna ^en liksom i patologiska processer, såsom neuropatisk smärta ^2. Deras nära ytan positionering underlättar mikroskopisk avbildning av hudens nervändar i levande intakta djur. Med hjälp av multifoton mikroskopi, är det möjligt att få fina bilder övervinna problemet med starka ljusspridning i hudvävnaden. Reporter transgena möss som uttrycker EYFP under kontroll av Thy-1 promotor i neuroner (inklusive periferin sensoriska neuroner) är väl lämpade för longitudinella studier av enskilda nervändar över längre tidsperioder upp till flera månader eller till och med livslång. Dessutom använder samma femtosecond laser för avbildning, är det möjligt att producera mycket selektiva lesioner av nervfibrer för studier av omstruktureringen nervfiber. Här presenterar vi en enkel och tillförlitlig protokoll för longitudinell multifoton in vivo imaging ochlaserbaserade mikrokirurgi på mus hud nervändar.

Introduction

Kutan nervändar genomgår dynamiska förändringar under olika patofysiologiska tillstånd. Nervtrådarna kan gå igenom processen för degeneration och regeneration eller omstrukturering under sådana sjukdomar som perifer neuropati ² eller Mortons neurom ^3. Efter traumatisk skada, är en viktig del av nervändar dynamik i huden reinnervation av det skadade området. Men den gemensamt tillvägagångssätt för undersökning av nervändar ex vivo histologisk snitt som saknar realtidsinformation om de pågående processerna ^4. Med hjälp av genetiskt kodade fluorescerande markörer, är det möjligt att spåra nervändarna i huden på levande djur och på så sätt få rika och betydligt mer relevant information om de strukturella förändringarna. Undersökningen av kutana nervändar som är möjligt med konventionell fluorescensmikroskopi dock det starka ljusspridning i hudvävnaden gräver starkt kvalitetenav de uppgifter som förvärvat ^5. Multifoton mikroskopi medger förvärv av högupplösta bilder i starkt spridande vävnader på grund av den icke-linjära summering av energin i excitation ljus fotoner som resulterar i utsläpp av fluorescens bara ur fokus för målet. Denna effekt leder till en robust ökning i penetrationsdjup och förbättring av signal-till-brusförhållandet för mätningen i hudvävnader ^6. Med samma laser som för avbildning, är det möjligt att framställa selektiva dissektion av nervfibrer ^7. I följande protokoll visar vi metoden för longitudinella avbildning av kutana nervändar i vivo i reporter transgena möss i kombination med selektiv laserskada med hjälp av kommersiellt tillgängliga multifotonmikroskopsystem.

Protocol

Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av National Animal Experiment Styrelsen, Finland. 1 Animal Förberedelse för Imaging Bedöva en mus med intraperitional (IP) injektion av ketamin (0.08 mg per kroppsvikt) och xylazin (0,01 mg per kroppsvikt). Kontrollera anestesi med den bakre tå nypa reflex. Doppa djurets ögon i ögondroppar (Viscotears) för att skydda ögonen från uttorkning. Placera musen på en värmedyna (Supertech) vid 37 ° C för att förhindra hypoterm…

Representative Results

Med användning av den beskrivna tekniken är det möjligt att spåra samma fiber efter lesionen och för att studera degraderingen av de skadade nervändar (Figur 1). Förvärv av stapeln med tjockleken 120-150 nm brukar lämplig för repetitiva avbildning under flera dagar för att hålla hela fibern i synfältet. Lesionen typiskt kan produceras koncist när plastförpackningsmaterialet justeras för att platta ut huden, så de koUagenskikten visas med likformig intensitet…

Discussion

I den här videon protokoll visar vi metoden för icke-invasiv longitudinell två-foton avbildning av enstaka nervändar.

Dynamiken i hud innervations påverkas vid sådana sjukdomar som psoriasis och perifer neuropati ^2, och i traumatiska skador ^9. Två-foton avbildning möjliggör detaljerad analys av nervfibrer strukturer i kollagenmatrisen. Användningen av transgena reporter möss hjälper till att undvika problemen med färgning av nervtrådar. Thy1-YFP-H-stammen …

Materials

Round cover glass	Electron Microscopy Science	72296-05	5 mm diameter #1.5 thickness
Eye drops Viscotears	Novartis		2mg/g
Superglue Loctite 401	Henkel	135429
Ketaminol	Intervet		Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight)
Rompun	Bayer Healthcare		Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight)
			Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS
Ethanol 70%
Distilled water or Milli-Q water
Syringes 1ml	BD	300013
30G 1/2" needles	BD	304000
Plastic packaging material			Could be purchaized from general hardware store
FV-1000MPE microscope	Olympus	FV-1000MPE	Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation
25X XLPlan objective	Olympus	XLPLN 25XWMP	Water imersion objective optimized for multiphoton imaging
Mai-Tai DeepSee laser (2W)	SpectraPhysics
Heating pad	Supertech	TMP-5b	Heating pad with a temperature controller
Metal ring fixator	Neurotar Ltd.
ImageJ	NIH		Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/
Thy1-YFPH mice strain	JaxLab	003782