Cilt Tek Sinir Endings Vivo İki-Foton Mikrokopisi
Summary
Dinamik boyuna görüntüleme ve muhabiri transgenik farelerin sinir uçlarının selektif lazer lezyon için protokol sunulmuştur.
Abstract
Deride sinir uçları, nöropatik ağrı 2 gibi 1 algılamak olarak hem de patolojik süreçlerde fizyolojik süreçlerde görev alır. Onların yakın-yüzey konumlandırma sağlam hayvan canlı cilt sinir uçlarının mikroskopik görüntüleme kolaylaştırır. Multiphoton mikroskopisi ile cilt dokusunun güçlü ışık saçılma sorunun üstesinden gelmek iyi görüntü elde etmek mümkündür. (Çevre duyu nöronları dahil olmak üzere) nöronlarda Thy-1 promotörünün kontrolü altında eksprese EYFP Raportör transgenik fareler ile birkaç aya kadar ya da yaşam boyu uzun bir süre boyunca tek tek sinir uçlarının uzunlamasına çalışmalar için uygundur. Ayrıca, görüntüleme için aynı femto saniye lazer kullanarak, bu sinir lifi yeniden çalışmalar için sinir lifleri yüksek ölçüde seçici lezyonlar üretmek mümkündür. Burada, in vivo görüntüleme uzunlamasına multiphoton için basit ve güvenilir bir protokolü vefare deri sinir uçları lazer tabanlı mikro.
Introduction
Kutanöz sinir uçlarının farklı patofızyolojik altında dinamik değişikliklere uğrarlar. Sinir lifleri periferik nöropati 2 veya Morton nöroma 3 gibi hastalıkların seyrinde dejenerasyon ve rejenerasyon veya yeniden yapılanma sürecinde gidebilirsiniz. Travmatik yaralanma sonra, deri sinir uçlarının dinamiklerinin önemli bir parçası hasarlı alanın reinnervasyon olduğunu. Ancak, sinir uçlarının soruşturma ortak bir yaklaşım devam eden süreçler 4 gerçek-zamanlı bilgi eksikliği, ex vivo histolojik kesit olduğunu. Genetik olarak kodlanmış floresan markör kullanılarak, bu nedenle yapısal değişikliklerle ilgili zengin ve önemli ölçüde daha fazla ayrıntılı bilgi elde edilmesi, canlı hayvanların derisinde sinir uçlarını izlemek mümkündür. Deri altı sinir uçlarının araştırılması geleneksel fluoresan mikroskobu, ancak, cilt dokusunun güçlü ışık saçılım güçlü kalite zayıflatmaktadır kullanarak mümkündürVerilerin 5 satın almıştır. Multiphoton mikroskopi nedeniyle sadece objektif odak noktasından floresan emisyonu uyarma ışık fotonlarının enerjisi olmayan doğrusal toplamına kuvvetle saçılma dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüler elde edilmesine izin verir. Bu etki, deri dokuları 6 ölçüm için sağlam bir penetrasyon derinliği artışı ve sinyal-gürültü oranının bir gelişmeye yol açar. Görüntüleme için kullanılan aynı lazer kullanarak, bu sinir liflerinin 7 seçici diseksiyon üretilmesi mümkündür. Aşağıdaki protokolde seçici lazer lezyonu ticari olarak temin multiphoton mikroskop sistemi kullanılarak raportör ile birlikte transjenik farelerde in vivo olarak deri altı sinir uçlarının uzunlamasına görüntüleme yöntemini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu video protokolü biz tek bir sinir uçlarının non-invaziv uzunlamasına iki foton görüntüleme yöntemini göstermektedir.
Cilt innervasyon dinamikleri, sedef hastalığı ve periferik nöropati 2, gibi hastalıkların, ve travmatik yaralanmalar 9 etkilenir. İki foton görüntüleme kollajen matris içinde sinir lifleri yapıların detaylı analiz sağlar. Transgenik raportör farelerin kullanılması sinir liflerinin boyama ile ilgili problemleri önler. Thy1-m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mali destek için teknik yardım, CIMO Vakfı ve FGSN için Neurotar Ltd teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Round cover glass | Electron Microscopy Science | 72296-05 | 5 mm diameter #1.5 thickness |
| Eye drops Viscotears | Novartis | 2mg/g | |
| Superglue Loctite 401 | Henkel | 135429 | |
| Ketaminol | Intervet | Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 µg per gramm of animal weight) | |
| Rompun | Bayer Healthcare | Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 µg per gramm of animal weight) | |
| Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS | |||
| Ethanol 70% | |||
| Distilled water or Milli-Q water | |||
| Syringes 1ml | BD | 300013 | |
| 30G 1/2" needles | BD | 304000 | |
| Plastic packaging material | Could be purchaized from general hardware store | ||
| FV-1000MPE microscope | Olympus | FV-1000MPE | Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation |
| 25X XLPlan objective | Olympus | XLPLN 25XWMP | Water imersion objective optimized for multiphoton imaging |
| Mai-Tai DeepSee laser (2W) | SpectraPhysics | ||
| Heating pad | Supertech | TMP-5b | Heating pad with a temperature controller |
| Metal ring fixator | Neurotar Ltd. | ||
| ImageJ | NIH | Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| Thy1-YFPH mice strain | JaxLab | 003782 |
Riferimenti
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
- Wu, K. K. Morton’s interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results. J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).
- Lauria, G., Lombardi, R. Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy. BMJ. 334, 1159-1162 (2007).
- Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu. J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).
- Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo. J Vis Exp. (46), e2062 (2010).
- Sacconi, L., O’Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Robinson, L. R. Traumatic injury to peripheral nerves. Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).
- Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).
- Amit, S., Yaron, A. Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model. J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).
- Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats. Mol Pain. 7, 63 (2011).
- Yuryev, M., Khiroug, L. Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy. J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).
