Summary
Almindeligt anvendte, er meget tilgængelige metoder til at undersøge celle migration og invasion in vitro beskrevet. Den første metode er den celle sårlukning assay, der måler cellemotilitet. Den anden metode er den transwell migration og invasion assay, der vurderer det kemotaktiske og invasive kapacitet af celler.
Abstract
Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.
Introduction
Motilitet er et væsentligt element i levende celler. Cell migration er involveret i udformningen af livet, fosterudvikling, immunrespons, og mange patologiske processer, såsom cancer metastaser og inflammation 1-9. Derfor metoder til at studere celle vandringsadfærd er meget nyttige forskning værktøjer til en bred vifte af discipliner i biomedicinske videnskaber, biologi, bioteknik og felter relateret.
Studiet af celle migration i kræftforskning er af særlig interesse som den vigtigste dødsårsag i kræftpatienter er relateret til metastatisk progression. For kræft til at sprede og udbrede i hele kroppen, skal kræftceller migrere og invadere gennem ekstracellulær matrix (ECM), intravasate i blodcirkulationen, tillægger et fjernt sted, og endelig ekstravasere at danne fjernt foci 1,10-12. Forskellige biologiske metoder kan anvendes til at studere disse begivenheder i detaljer. Cellekultur sår lukning en Dend den transwell migration og invasion assays er meget udbredt i det videnskabelige samfund 1,10. Disse tests kan give den nødvendige data, der kan give mulighed for en forståelse af, hvor godt en bestemt celletype kan spontant migrere eller svare på en kemo-lokkemidler og retningsbestemt migrere mod det. Adskillige vandrende fænotyper er blevet beskrevet. Celler kan migrere i en enkelt celle form, som det ses i mesenchymale eller amoeboid-lignende bevægelse eller flercellede bevægelse mærket kollektiv migration eller celle streaming 13. Fremgangsmåden til bevægelse anvendes i motile celler kan let observeres ved hjælp af cellekultur sårlukning assay.
Blandt de mange måder at studere cellemigrering cellen sårlukning assayet er en af de enkleste. Denne metode er nyttig til at bestemme migrationen evne helcelle masserne. Når taget et skridt videre den kan bruges til at observere de enkelte celles morfologiske kendetegn ved migration 14. Efter analysen af sårlukning mange fænotyper kan blive afsløret. Måling af lukkede distance over tid, når man sammenligner med en kontrol kan afsløre specifikke ændringer migration eller en forringet vandrende fænotype, der var ukendt tidligere. Desuden kan enkelt celle lamellipodium dannelse, hale tilbagetrækning, og retningsbestemt bevægelse give fingerpeg til, hvad der kan blive forringet eller forøget i cellerne af interesse 14.
The transwell migration og invasion-assays kan anvendes til at analysere evnen af enkelte celler til retningsbestemt reagerer på forskellige kemo-tiltrækningsmidler om de er kemokiner, vækstfaktorer, lipider eller nukleotider 4,5,8,15,16. Det kan også vurdere forskellen vandrende evne på grund af overekspression af en receptor 1,14. Disse assays kan også anvendes til at identificere og karakterisere de vigtige regulatorer af cellemigrering, såsom Rho familie af små GTPaser 2. Efter disse korte og let tilgængeligerende prøver, den tilstand af cellemigrering og en celles evne til at invadere i en 3-D matrix kan også bestemmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration er et vigtigt aspekt at studere i kræftforskning, og det kan også anvendes til udviklingsmæssige, immunologiske og sårheling studier. Cellekulturen sårlukning assay og transwell celle migration og invasion-assays afslører detaljerede oplysninger om celle vandrende adfærd og kan anvendes til at undersøge de molekylære mekanismer i cellemigrering 1,2,10,14. Vores undersøgelse brugt disse celle motilitet assays til at bestemme migrationen hastigheds-og invasion kapaciteter en B16F10 mela…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia & Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
Riferimenti
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
