In vitro Cell Migration och Invasion Analyser
Summary
Vanligen används, är mycket tillgängliga metoder för att undersöka cellmigration och invasion in vitro beskriven. Den första metoden är den cell sårtillslutning analys som mäter cellrörlighet. Den andra metoden är den transwell migration och invasionsanalys som bedömer den kemotaktiska och invasiv förmåga hos celler.
Abstract
Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.
Introduction
Motilitet är ett väsentligt inslag i levande celler. Cell migration är involverad i utformningen av livet, embryonal utveckling, immunsvar, och många patologiska processer såsom cancer metastasering och inflammation 1-9. Därför, metoder för att studera cell flyttande beteende är mycket användbara forskningsverktyg för ett brett spektrum av discipliner inom biomedicinsk vetenskap, biologi, bioteknik och närliggande områden.
Studien av cellmigration i cancerforskningen är av särskilt intresse eftersom den främsta dödsorsaken hos cancerpatienter är relaterad till metastasutvecklingen. För för cancer att sprida sig och sprida i hela kroppen, måste cancerceller migrera och invadera genom extracellulär matrix (ECM), intravasate i blodcirkulationen, bifoga till en avlägsen plats, och slutligen extravasera att bilda avlägsen härdar 1,10-12. Olika biologiska metoder kan användas för att studera dessa händelser i detalj. Cellodlings sår stängning end den transwell migration och invasion analyser används allmänt i den vetenskapliga gemenskapen 1,10. Dessa tester kan ge nödvändig information som kan möjliggöra en förståelse för hur väl en viss celltyp spontant kan migrera eller svara på en kemo-attraherande och riktnings migrera mot den. Flera flyttande fenotyper har beskrivits. Celler kan migrera i en enda cell form, såsom ses i mesenkymala eller amöboid liknande rörelser eller genom multicellulär rörelse märkt kollektiv migration eller cellsändning 13. Metoden för rörelse används i rörliga celler lätt kan observeras med användning av cellodlings sårtillslutning assay.
Bland de många sätt att studera cellmigration, är cellen sårtillslutning analys en av de enklaste. Denna metod är användbar för att bestämma migrations förmågan hos hela cellmassor. När det tas ett steg längre det kan användas för att observera enskilda cellens morfologiska egenskaper under migration 14. Efter analysen av tillslutning av sår många fenotyper kan avslöjas. Att mäta den slutna sträcka över tid om man jämför med en kontroll kan avslöja specifika förändringar migration eller en försämrad flyttande fenotyp som var okända tidigare. Dessutom kan enstaka cell lamellipodium bildning, svans indragning, och riktad rörelse ger ledtrådar för vad som kan försämras eller förbättras i cellerna av intresse 14.
Den transwell migration och invasion analyser kan användas för att analysera förmågan hos enskilda celler till directionally svara på olika kemo-attraherande medel oavsett om de är kemokiner, tillväxtfaktorer, lipider, eller nukleotider 4,5,8,15,16. Det kan också bedöma differential flyttande förmåga på grund av överuttryck av en receptor 1,14. Dessa analyser kan också användas för att identifiera och karakterisera de viktiga regulatorer av cellmigration, såsom Rho-familjen av små GTPaser 2. Efter dessa kort och lätt få tillgångligt tester, sättet cell migration och förmågan hos en cell att invadera in i en 3D-matris kan också bestämmas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cell migration är en viktig aspekt att undersöka inom cancerforskningen och det kan också tillämpas på utvecklings, immunologiska och sårläkningsstudier. I cellodling sårtillslutning analys och migrationstranswell cellen och invasionsanalyser avslöjar detaljerad information om cellmigrations beteenden och kan användas för att undersöka de molekylära mekanismerna av cell migration 1,2,10,14. Vår studie använde dessa cellmotilitet analyser för att fastställa migration hastighet och invasion fun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia & Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
Riferimenti
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
