הדמיית הלבלב Neuroplasticity:<em> במבחנה</em> Dual-נוירון פלסטיות Assay
Summary
פלסטיות עצבית היא תכונה מוכרת יותר ויותר, אבל הבינה מספיק של מערכת העיכול (GI). כאן, בדוגמא של הפרעות לבלב אנושיות, אנו מציגים assay neuroplasticity במבחנה לחקר פלסטיות עצבית במערכת העיכול ברמה שני מורפולוגיים ופונקציונלית.
Abstract
Neuroplasticity הוא תכונה טבועה בעצבוב המערכת ומערכת עיכול (GI) העצבים enteric תחת מצבים פתולוגיים. עם זאת, תפקיד pathophysiological של neuroplasticity בהפרעות במערכת העיכול נותר עלום. מודלים ניסיוניים חדשניים המאפשרים סימולציה ואפנון של neuroplasticity GI עשויים לאפשר הערכה משופרת של התרומה של neuroplasticity במחלות במערכת העיכול מסוימים, כגון סרטן לבלב (PCA) ודלקת לבלב כרוני (CP). כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימולציה של neuroplasticity לבלב תחת במבחנה תנאי שימוש בגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) ומקלעת myenteric הנוירונים (MP). גישה הכפולה נוירון זה מאפשר לא רק ניטור של שני neuroplasticity האיברים פנימיים וחיצוניים, אלא גם מהווה כלי רב ערך כדי להעריך עצבי ומורפולוגיה ואלקטרופיזיולוגיה גליה. יתר על כן, היא מאפשרת אפנון תפקודי של תוכן microenvironmental סיפק ללימוד Impacלא על neuroplasticity. ברגע שהוקם, assay neuroplasticity הנוכחי נושא את הפוטנציאל להיות ישים לחקר neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.
Introduction
שינויים במורפולוגיה במערכת העיכול (GI) עצב וצפיפות תפסו את תשומת הלב של גסטרואנטרולוגים ופתולוגים במשך זמן רב, אבל הרלוונטיות שלהם להפתופיזיולוגיה של מחלות במערכת העיכול אינן ידועות 1-3. ואכן, כמה הפרעות במערכת העיכול נפוצות מאוד כגון דלקת קיבה, ושט ריפלוקס, דלקת המעי הגס, דלקת, ודלקת תוספתן קשורות עם צפיפות עצבוב מוגברת באזורי רקמה דלקתיים 1. עם זאת, לא שמו לב אמיתי עד כה שילם למנגנונים והמשמעות של neuroplasticity במערכת העיכול. האם עצבים במערכת העיכול מורפולוגית שינו שונים מעצבים במערכת העיכול נורמלים, כלומר המצב הנורמלי של מערכת העצבים enteric, במונחים של תפקידם? מהן ההשלכות של תוכן נוירופפטידים / הנוירוטרנסמיטר שינו בעצבי enteric פלסטיק? האם neuroplasticity ההיקפי תמיד כרוך איתות שינתה למערכת העצבים המרכזית? ואיפה התחזיות של extri פלסטיק המרכזיותמסלולים עצביים במערכת העיכול NSIC? סדרה ארוכה של שאלות מפתח כגון בקלות יכולה להיות שנוצרה כשמסתכלת על המחסור בידע שלנו על ההיבטים הפונקציונליים של neuroplasticity במערכת העיכול.
המחקר של neuroplasticity GI ברמה תפקודית דורש מודלים ניסיוניים בתוקף, לשחזור ועדיין ישימים בקלות. בעידן של הגדלת פופולריות וקבלה של מודלים מהונדסים גנטי מותנים עכבר (GECoMM), כגון בהגדרות vivo לשאת את הפוטנציאל להבהיר היבטים ידועים קודם לכן של neuroplasticity GI בצורה מציאותית 1. עם זאת, העיצוב והייצור של GECoMM נשאר יקרים, עתיר עבודה, ובמיוחד בזמן אכילה. יתר על כן, הם דורשים בחירה מראש של היעד להיות מווסת על תנאי בעכבר עבר שינוי הגנטי (ביטוי יתר למשל מהונדס של גורם גדילה העצבי / NGF בתאי האפיתל enteric). לפיכך, עבור desIGN של GECoMM מוצלח, חוקרים צריכים כמה אינדיקטורים (למשל נתוני ניסוי קודמים) של יעד כדאי, כלומר, שהמולקולה של עניין (כאן NGF) יכולה לפחות להיות צפויה להפעיל לכמה תופעות רלוונטיות מבחינה ביולוגית על עצבים במערכת העיכול.
בקלות ניתן לגזור אינדיקטורים כגון מנאותים במודלים של מבחנה שבה תת תא מבודד מmicroenvironment המורכב של מערכת vivo בניתן cocultured סלקטיבי באופן heterotypic 4-7. האפנון של מטרות מולקולריות בהגדרת תרבות heterotypic כזה הוא בממוצע מבחינה טכנית מסורבל פחות, מהיר יותר, ולכן יכול לסייע בprefiltering מטרות כדאיות עבור אימות במחקרי vivo.
לאחרונה, הצגנו במבחנה assay neuroplasticity שנועד לדמות את הצפיפות המוגברת עצבית והיפרטרופיה של ne intrapancreaticrves בסרטן לבלב אנושי (PCA) ודלקת לבלב כרוני רקמות (CP). הנה, הנוירונים הנגזרים מגרעיני יילוד הגבי חולדה שורש (DRG) או מקלעת myenteric (MP) נחשפו לתמציות רקמה מPCA כריתה בניתוח או CP דגימות רקמות והשוואה לאלה בתרבית בלבלב אנושי נורמלי (NP) תמציות רקמה 5. במקום תמציות רקמה, אפשר גם להשתמש supernatants שורת התאים לחקור את ההשפעה של סוגי תאים שנבחרו על neuroplasticity. בשילוב עם מדידת morphometric סטנדרטית, assay neuroplasticity הציג מאפשר הערכה תקפה ושחזור של פלסטיות עצבית בתגובה לmicroenvironments לבלב שונה. במיוחד, היא מאפשרת הסימולציה של 1) neuroplasticity מורפולוגי, כלומר השינויים בתולדת neurite, הסתעפות דפוס וגודל עצבי, ו2) neuroplasticity הפונקציונלי, כלומר שינויים ברגישות של תאי עצב היקפיים. יתר על כן, לא רק פריפריה (כלומר </em> Enteric), אלא גם מרכזי (כגון: DRG או בעמוד השדרה צו שני) יכולים להיכלל הנוירונים בassay ההווה כדי לבחון את התגובה מורפולוגיים ופונקציונלית שלהם לתכני רקמות במערכת העיכול שונים. בוידאו של מורה בהווה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול הטכני לביצוע assay זה ולדון ביתרונות והחסרונות שלה. יתר על כן, אנו מפנים את תשומת לב לתחולתו של הרעיון הבסיסי של assay זה ללימוד neuroplasticity בכל איבר במערכת העיכול.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי נועד כדי להמחיש את המתודולוגיה מאחורי assay neuroplasticity הלבלב במבחנה אשר פותח לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו כדי ללמוד את המכניזם של neuroplasticity בPCA וCP 5. הפרוטוקול כרוך בהליך של שלושה ימים אשר יכול בקלות להיות מיושם ברגע שהשחקן צבר מספיק ניסיון בבידוד …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל המחברים תרמו להקמת והאימות של assay הציג ולטיוטה של כתב היד.
Materials
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13mm coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life sciences | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Gibco/Life sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibco/Life sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
Riferimenti
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. . Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
